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1.山西醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)院消化內科，山西 太原 030001；2.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院重癥肝病科；3.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院北京市肝病研究所；4.山西省腫瘤醫(yī)院 山西省腫瘤研究所

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of kaempferol on the apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells.MethodsHepG2 cells were incubated with different concentrations of kaempferol for 24 hours to select the best drug concentration (100 μmol/L), and HepG2 cells were incubated at different times. Cell viability was measured by MTT assay; lactate dehydrogenase (LDH) activity in cell supernatants was measured by LDH assay kit; apoptosis was measured by flow cytometry. The expression of apoptosis-related protein was detected by Western blotting.ResultsKaempferol had the induced effect on apoptosis of HepG2 cells in a dose- and time-dependent. When HepG2 cells were treated with kaempferol for 24 hours, the cells viability was gradually decreased and the apoptotic rate was increased gradually with the increase of kaempferol concentrations. Compared with the normal control group, in the 100 μmol/L kaempferol for 24 hours group, the cells survival rate was significantly decreased [(60.58±3.74)%vs(100±2.28)%,P<0.0001], and the apoptotic rate was significantly increased [(16.43±0.07)%vs(0.68±0.09)%,P<0.0001]. The expression of apoptotic factor Cleaved-caspase3 protein was increased with the increase of kaempferol concentrations， HepG2 cells were incubated with kaempferol for 24 hours by Western blotting. When the kaempferol concentration was 100 μmol/L, the apoptotic rate also was increased gradually with the prolongation of time when HepG2

cells were incubated with kaempferol. Compared with the normal control group, in the 100 μmol/L kaempferol for 24 hours group, the cell survival rate was significantly decreased [(59.36±3.09)%vs(100±2.28)%,P<0.0001], and the apoptotic rate was significantly increased [(16.71±1.12)%vs(0.35±0.01)%,P<0.0001]. The expression of apoptotic factor Cleaved-caspase3 was increased with the prolongation of time.ConclusionKaempferol has an induced effect on the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells in dose- and time-dependent. It indicats that high concentration of kaempferol could induce the apoptosis of HepG2 cells by promoting the expression of apoptotic factor Cleaved-caspase3, and thus it has the potential effect on anti-hepatocarcinoma activity.

【Keywords】 Kaempferol； HepG2 cells； Cell apoptosis； Mechanism

山萘酚是一種多酚類抗氧化物，為天然黃酮類化合物的一種(化學結構見圖1)，其主要來源于姜科植物山萘的根莖，中草藥淫羊藿、石菖蒲、苦參、山豆根等均含有此成分，同時廣泛存在于日常食用的蔬菜、水果當中。山萘酚具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、保肝等功效。據(jù)研究證實，山萘酚可通過阻礙NF-κB信號通路來抑制炎癥因子IL-6、TNF-α的表達，可對因為炎癥因子誘發(fā)的哮喘、肝細胞炎癥等發(fā)揮預防及治療作用；山萘酚具有激活過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR-γ)的作用，從而提高胰島素敏感性，增強葡萄糖儲存能力，其中PPAR-γ激動劑已成為脂質代謝異常和2型糖尿病的常用藥物，據(jù)此推測山萘酚將可能成為治療糖尿病的臨床用藥；山萘酚還可提高細胞氧化應激能力，降低活性氧的產(chǎn)生，有顯著的抗氧化活性，具有抗心肌細胞缺氧復氧損傷作用。山萘酚不僅有如上作用，還有誘導癌細胞凋亡的功效，據(jù)相關研究[5-8]表明，山萘酚有抗胃癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌等功能，然而關于山萘酚對肝癌的研究為數(shù)甚少且相關機制說法不一。所以本次研究通過體外實驗，來探討山萘酚對于人類肝癌細胞HepG2凋亡的影響，從而為日后山萘酚用于藥品研發(fā)及肝癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

圖1 山萘酚化學結構Fig 1 The chemical structure of kaempferol

1 材料與方法

1.1材料山萘酚(純度>95%)、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；噻唑藍(MTT)購自美國Amresco公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；乳酸脫氫酶(LDH)活力定量檢測試劑盒購自普利萊基因技術有限公司；Annexin V-FITC PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；ECL化學發(fā)光液購自美國Thermo公司；β-actin、Cleaved-caspase3抗體和辣根酶標記兔抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細胞培養(yǎng)人肝癌細胞系HepG2細胞購自美國ATCC公司，于含質量濃度為100 g/L的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中(孵箱氣體體積分數(shù)為5%的CO2、溫度為37 ℃、飽和濕度)傳代培養(yǎng)。

1.3藥品配制山萘酚溶于DMSO，配制為5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的儲存濃度。

1.4藥物干預取對數(shù)生長期的HepG2細胞以1×104/孔接種于96孔板里培養(yǎng)，24 h后換成含有山萘酚濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的培養(yǎng)基，同時設溶劑對照組(DMSO終濃度為2 g/L)和空白對照組，孵育HepG2細胞24 h。再以濃度為100 μmol/L山萘酚的培養(yǎng)基孵育HepG2細胞3 h、6 h、12 h、24 h。

1.5MTT法檢測細胞存活率按上述方法進行細胞培養(yǎng)及藥物干預，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT(0.5 mg/ml)200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT，每孔加DMSO 150 μl，震蕩器震蕩10 min，于酶標儀490 mm處波長測定吸光度值(OD值)，計算細胞存活率，公式如下：細胞相對存活率(%)=(藥物處理組OD值-空白對照組OD值)/(溶劑對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.6細胞上清LDH檢測按上述方法進行細胞培養(yǎng)及藥物干預后，留取細胞上清液，按LDH試劑盒說明書進行操作，酶標儀測定A440值，根據(jù)標曲計算細胞上清液LDH活性單位。

1.7流式細胞術檢測山萘酚干預HepG2細胞對凋亡的影響細胞培養(yǎng)及藥物干預如上，收集細胞上清置于15 ml離心管中，用質量濃度為2.5 g/L的胰酶消化細胞，并將細胞收集于同一離心管中，離心，1 000 r/min，離心半徑為5 cm，5 min，棄掉細胞上清，用1×PBS洗滌細胞2次，加入500 μl結合緩沖液，將細胞移入流式管，每管加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光，室溫放置15 min，流式細胞儀進行檢測。

1.8蛋白印記法檢測Cleaved-caspse3蛋白的表達細胞培養(yǎng)及藥物干預如上，棄上清，用1×PBS洗3次，收集細胞于1.5 ml離心管中，每管加入500 μl細胞裂解液(含有蛋白酶抑制劑)，-80 ℃與4 ℃之間反復凍融3次，定量后取適量蛋白上樣，質量濃度為120 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜(聚偏氟乙烯膜，30 V，4 ℃，過夜)，一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，1.5 h，二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，1.5 h。取等量的ECL化學發(fā)光試劑A液和B液混勻后孵育聚偏氟乙烯膜，壓片曝光。

2 結果

2.1山萘酚對HepG2細胞存活率的影響山萘酚作用于HepG2細胞24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L山萘酚組細胞的存活率分別為(103.12±3.53)%、(94.87±5.34)%、(86.73±7.67)%、(75.23±6.98)%、(60.58±3.74)%。其中濃度為50 μmol/L、100 μmol/L組細胞存活率與空白對照組(100±2.28)%相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖2A)。山萘酚濃度為100 μmol/L作用于HepG2細胞3 h、6 h、12 h、24 h后細胞存活率分別為(104.73±3.84)%、(87.58±6.98)%、(74.68±5.41)%、(59.36±3.09)，12 h、24 h藥物處理組與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2B)。

圖2 山萘酚對HepG2細胞生存率的影響

A：不同濃度山萘酚作用于HepG2細胞對其生存率的影響；B：濃度為100 μmol/L的山萘酚作用不同時間對HepG2細胞生存率的影響

Fig2TheeffectsofkaempferolonthesurvivalrateofHepG2cells

A: the effects of different concentrations of kaempferol on the survival rate of HepG2 cells; B: the effects of kaempferol at the concentration of 100 μmol/L on the survival rate of HepG2 cells at different time

2.2山萘酚對HepG2細胞上清LDH活性的影響山萘酚5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L孵育HepG2細胞24 h后，細胞上清LDH活性單位分別為(198.4±10.35)U、(368.71±4.69)U、(392.36±3.97)U、(432.46±11.82)U、(471.37±8.16)U，除了濃度為5 μmol/L組，其余各組與空白對照組(213.7±10.89)U兩兩相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖3A)。濃度為100 μmol/L的山萘酚作用于HepG2細胞3 h、6 h、12 h、24 h后，細胞上清LDH活性單位分別為(228.03±17.71)U、(231.52±18.13)U、(312.52±18.79)U、(429.76±12.76)U。其中12 h、24 h與空白對照組(165.62±12.28)U比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖3B)。

2.3山萘酚對HepG2細胞凋亡率的影響不同濃度的山萘酚作用于HepG2細胞24 h后均能誘導細胞凋亡，其中濃度為100 μmol/L山萘酚干預組細胞凋亡率為(16.43±0.07)%，顯著高于空白對照組(0.68±0.09)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；山萘酚濃度為100 μmol/L，作用時間3 h、6 h、12 h、24 h細胞凋亡率分別為(5.23±0.08)%、(7.41±0.01)%、(11.9±0.95)%、(16.71±1.12)%，與空白對照組(0.35±0.01)%相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4)。

2.4山萘酚誘導HepG2細胞凋亡對Cleaved-caspase3蛋白的影響蛋白印跡法檢測凋亡標志性蛋白Cleaved-caspase3的表達，實驗以β-actin為內參。結果證實，當山萘酚作用于HepG2細胞24 h后，隨著山萘酚濃度的升高，凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達增加(見圖5A)；當使用濃度為100 μmol/L山萘酚干預HepG2細胞時，凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表達隨著作用時間的延長表達也增加(見圖5B)。

圖3 山萘酚對HepG2細胞上清LDH酶活性影響

A：不同濃度山萘酚作用于HepG2細胞對其細胞上清LDH酶活性的影響；B：濃度為100 μmol/L的山萘酚作用不同時間對HepG2細胞上清LDH酶活性的影響

Fig3TheeffectsofkaempferolonLDHenzymeactivityinHepG2cellssupernatant

A: the effects of different concentrations of kaempferol on LDH enzyme activity in HepG2 cells supernatant; B: the effects of kaempferol at the concentration of 100 μmol/L on LDH enzyme activity in HepG2 cells supernatant

圖4 山萘酚對HepG2細胞凋亡率的影響

A～B：不同濃度山萘酚作用于HepG2細胞間對其細胞凋亡率的影響；C～D：濃度為100 μmol/L的山萘酚作用不同時間對HepG2細胞凋亡率的影響

Fig4TheeffectsofkaempferolonapoptoticrateofHepG2cells

A-B: the effects of different concentrations of kaempferol on the apoptotic rate of HepG2 cells; C-D: the effects of kaempferol at the concentration of 100 μmol/L on the apoptotic rate of HepG2 cells at different time

3 討論

肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國常見惡性腫瘤中目前排第4位，腫瘤致死病因排第3位，嚴重危害人類生命健康[9-10]。在中醫(yī)范疇中，肝癌可根據(jù)其臨床表現(xiàn)歸屬為“癥瘕”、“積聚”、“鼓脹”，而現(xiàn)代中醫(yī)藥可治療輕型癥狀，改善生命質量，延長生存時間，緩解毒副作用，在臨床上已成為不可或缺的治療手段。

圖5 山萘酚作用于HepG2細胞對其凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達的影響

A：不同濃度山萘酚作用于HepG2細胞對其凋亡蛋白
Cleaved-caspase3表達的影響；B：濃度為100 μmol/L的山萘酚作用不同時間對HepG2細胞凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達的影響

Fig5TheeffectsofkaempferolontheexpressionofapoptosisproteinCleaved-caspase3inHepG2cells

A: the effects of different concentrations of kaempferol on the expression of apoptosis protein Cleaved-caspase3 in HepG2 cells; B: the effects of kaempferol at the concentration of 100 μmol/L on the expression of apoptosis protein Cleaved-caspase3 in HepG2 cells at different time

山萘酚是一種黃酮類化合物，具有廣泛的生物學作用。近年來，關于山萘酚抗癌方面的大量研究證實了一定濃度的山萘酚可通過不同的機制抑制結腸癌、胃癌[6]、膽管癌[7]、口腔癌[11]等癌細胞增殖轉移、侵襲擴散，并促進癌細胞凋亡。如QIN等[7]研究表明，山萘酚影響PI3K/AKT信號通路從而抑制膽管癌細胞增殖代謝并誘導癌細胞凋亡；HUNG等[8]發(fā)現(xiàn)，山萘酚可以通過下調AKT/FAK信號通路來抑制腎癌細胞的增殖和轉移，從而預防癌細胞侵襲擴散。通過本次實驗的研究，結果表明，山萘酚能夠以劑量和時間依賴的方式誘導人類肝癌細胞系HepG2細胞凋亡，其作用機制是高濃度的山萘酚誘導凋亡因子Cleaved-caspase3表達，從而促使癌細胞凋亡。

凋亡自古謂之大量減少，據(jù)《陳書·世祖紀》記載：“自喪亂以來，十有馀載，編戶凋亡，萬不遺一，中原氓庶，蓋云無幾?！爆F(xiàn)代醫(yī)學定義細胞凋亡具體指由基因介導的程序性死亡，此過程可清除衰老和異常的細胞，從而維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Caspase家族是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶[12]，Caspase3是蛋白Caspase家族中重要的一員，Cleaved-caspase3是Caspase3的激活體，主要參與調控細胞凋亡及炎癥過程。當?shù)蛲霭l(fā)生時，各個凋亡信號通路最終激活Caspase3，從而誘導細胞凋亡。

本次實驗結果不僅表明山萘酚具有誘導肝癌細胞HepG2凋亡的作用，同時證實了單體山萘酚主要依賴藥物劑量誘導肝癌細胞凋亡。早期研究[13]證實，低濃度0.01、0.1 μmol/L山萘酚可以抑制正常肝細胞7702內質網(wǎng)應激所誘導的CHOP蛋白表達，減少細胞凋亡。當濃度增至1.00 μmol/L時，山萘酚對CHOP蛋白表達的抑制作用不顯著，且會產(chǎn)生細胞損傷作用。另一項研究[14]采用5～100 μmol/L的山萘酚孵育HepG2細胞24 h，用MTT法檢測藥物毒性，發(fā)現(xiàn)當藥物濃度<20 μmol/L時對細胞活性無顯著影響，但隨著藥物濃度增高，所產(chǎn)生的細胞毒性增強。同樣，本實驗結果也驗證了以上結論，當濃度為5 μmol/L時，山萘酚對細胞具有保護作用，與正常組相比，細胞活性增高且細胞上清LDH含量有所下降；當濃度為100 μmol/L時，山萘酚對細胞的毒性作用明顯增強，促進了細胞凋亡，顯著降低了細胞活性，增加了細胞上清LDH含量，且誘導凋亡相關蛋白Caspase3表達。同時隨著山萘酚濃度的增加，細胞活性降低，凋亡率升高，表明山萘酚隨濃度的升高，藥物毒性逐漸增加。隨后選取高濃度山萘酚孵育HepG2細胞，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，藥物毒性增加，細胞活性逐漸下降，凋亡率增高，凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3表達增強。本實驗結果表明，低濃度山萘酚對細胞可起到保護性作用，而高濃度山萘酚產(chǎn)生細胞毒性會誘導細胞損傷及凋亡，同時在高濃度狀態(tài)下，山萘酚孵育時間的延長對細胞的損傷會增加。

在本實驗中，我們研究了山萘酚對于人類肝癌細胞凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)，山萘酚以劑量-時間依賴性誘發(fā)肝癌細胞凋亡。經(jīng)山萘酚處理的肝癌HepG2細胞，隨著藥物濃度增加和孵育時間延長導致凋亡因子Cleaved-caspase3的表達逐步增強，表明山萘酚誘導肝癌HepG2細胞凋亡與提高Caspase3活性和藥物高濃度密切相關。研究后期可通過體內試驗進一步驗證山萘酚誘導肝癌細胞凋亡作用，為山萘酚的研究開發(fā)及臨床應用提供實驗基礎，并為肝癌的治療提供更多的選擇。

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