戴紅偉 周 嬌

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院，湖北省隨州市中心醫(yī)院，湖北 隨州 441300）

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）為一類造血干細(xì)胞的分化和成熟異常的克隆性疾病。流行病學(xué)顯示，ALL約占兒童急性白血病總病例的80%，成年人約占20%，3～7歲兒童為ALL好發(fā)人群。兒童ALL經(jīng)化療后90%以上可完全緩解，其5年無病生存率達(dá)70%～80%，但成人化療療效較差，5年生存率不到40%［1］。ALL患者因血小板的質(zhì)與量異?；虬籽〖?xì)胞對血管壁的浸潤性損害使?jié)B透性增加，常因嚴(yán)重的出血導(dǎo)致貧血和感染，但也偶有出血后發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），導(dǎo)致這一現(xiàn)象可能與原始ALL細(xì)胞釋放凝血酶、激酶等物質(zhì)有關(guān)。在ALL的病理進(jìn)程中，造血干細(xì)胞主要起源于T系或B系淋巴祖細(xì)胞，當(dāng)這些細(xì)胞出現(xiàn)惡性分裂增殖并取代正常細(xì)胞后，骨髓的正常成分被惡性細(xì)胞取代而發(fā)生凝血功能障礙，并最終因DIC而死亡［2］。故如何糾正凝血功能障礙，防止DIC是挽救患者生命的重要手段。近年來隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展和完善，對白血病的分類更加精準(zhǔn)，中藥的有效藥理成分在抑癌防癌方面有長足的發(fā)展，極大提高了白血病臨床療效。槲皮素為殼斗科植物伊比利亞櫟的皮和葉中提取的苷類化合物，除具有介導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)、抑制炎性介質(zhì)表達(dá)及抗腫瘤等作用外，還具有抑制血小板活化因子及凝血酶等誘導(dǎo)的血小板聚集作用［3-4］。因槲皮素對ALL凝血功能鮮有深入的活體研究，為降低ALL化療時(shí)的嚴(yán)重不良反應(yīng)及耐藥性，防治DIC，本研究以槲皮素和ALL模型小鼠為研究對象，觀察和分析其對凝血功能的影響，以期為其用于臨床輔助治療ALL提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 NOD/SCID小鼠60只，雌雄不拘，6～7 周齡，體質(zhì)量（19.5±1.5） g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2017-019］。將小鼠用隨機(jī)數(shù)字編號后隨機(jī)分為空白對照組、雙香豆素組、模型對照組、槲皮素0.75 mg/kg組、1.5 mg/kg組與3 mg/kg組各10只。

1.2 試劑及儀器 槲皮素 （北京索萊寶科技有限公司）；雙香豆素（上海鼓臣生物技術(shù)有限公司）；Nalm-6細(xì)胞（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；鼠抗人P-選擇素（P-selectin）、血管黏附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICMA-1）單克隆抗體及檢測試劑盒（上海滬震實(shí)業(yè)有限公司）；LC-2900型高效液相色譜儀 （上海天普分析儀器有限公司）；Berthold LB 942微孔板多功能酶標(biāo)儀（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）。

1.3 模型制備 將Nalm-6細(xì)胞37℃條件下解凍，然后接種于RPMI-1640培養(yǎng)基，放在通5%CO2氣體、37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待Nalm-6細(xì)胞呈對數(shù)生長期時(shí)，提取并調(diào)制成細(xì)胞總數(shù)為5×106個/mL的懸液。除空白對照組外均用5×106個Nalm-6細(xì)胞 （0.1 mL/鼠）尾靜脈注射建立ALL模型［5］。成模標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［6］：在注射造模2周后，小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、后肢癱瘓等癥狀并伴有肝脾增大、病檢顯示白血病細(xì)胞在肝脾及骨髓中彌漫性浸潤、靜脈血白細(xì)胞達(dá)（4.03±1.92）×109/L。

1.4 給藥方法 在注射造模2周后，空白對照組和模型對照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液 （0.2 mL/只）作為陰性對照，雙香豆素組腹腔注射雙香豆素（1.5 mg/kg）作為陽性對照，槲皮素0.75 mg/kg組、1.5 mg/kg組和3 mg/kg組按相應(yīng)劑量給予槲皮素腹腔注射治療，每組均每日1次腹腔注射，治療3周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）出、凝血時(shí)間及血小板3H-5HT釋放實(shí)驗(yàn)。治療結(jié)束后剝除小鼠眼球，吸取0.2 mL靜脈血儲存于無熱原、無內(nèi)毒素試管并編號備用。取血后采用玻片法和斷尾法觀察凝血時(shí)間（CT）和出血時(shí)間（BT）［7］。 高效液相色譜熒光法檢測血小板中 3H-5HT水平。2）雙抗體夾心法檢測ICMA-1、VCAM-1和P-selectin蛋白表達(dá)。取3組治療前后備用的靜脈血，于室溫放置，4℃過夜，1000×g離心20 min，取上清，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或各組待測上清100 μL，輕輕晃動混勻。酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育90 min。棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液100 μL（在使用前15 min內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，大約每孔350 μL，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。每孔加酶結(jié)合物工作液 （臨用前15 min 內(nèi)配制）100 μL， 加上覆膜，37 ℃溫育 30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液（TMB）90 μL，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。每個標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用curve expert 1.3專業(yè)曲線制作軟件分析，將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式計(jì)算出樣品濃度。3）凝血因子生成實(shí)驗(yàn)。凝血酶、內(nèi)/外源性凝血因子Xa生成量測定參照文獻(xiàn)［8］。取3組治療前后備用的靜脈血，取上述全血105個全血細(xì)胞，加入含5 mmol/L CaCl2、1 nmol/L 因子Ⅸa、0.2 mmol/L 凝血酶（Ⅱa）、5 nmol/L因子Ⅷ和130 nmol/L因子X的緩沖液共孵育10min，用7mmol/L的EDTA終止；加入0.8mmol/L顯色底物，用酶標(biāo)儀在405 nim波長處測定內(nèi)源性因子Ⅹa的生成量。將取上述全血105個全血細(xì)胞與含5 mmol/L CaCl2、130 nmol/L因子Ⅹ和1 nmol/L因子Ⅶa的緩沖液中共孵育10 min，用7 mmol/L的EDTA終止，然后加入0.8 mmol/L的顯色底物測定外源性因子生成量。將105個全血細(xì)胞加入含5 mmol/L CaCl2、1 nmol/L因子Ⅴa、0.05 nmol/L因子Ⅹa、1 nmol/L凝血酶原的緩沖液中共孵育10 min，用7 mmol/L的EDTA終止；加入0.8 mmol/L的S2238，用酶標(biāo)儀在405 nim波長處測定凝血酶生成量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)時(shí)資料以（±s）表示，多組間先進(jìn)行方差分析，組間兩樣本均數(shù)采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組P-selectin和黏附分子蛋白表達(dá)比較 見表1。經(jīng)抗體夾心法檢測，模型對照組P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表達(dá)水平明顯升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雙香豆素組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。槲皮素組呈劑量依賴性降低 P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表達(dá)，其中槲皮素3 mg/kg組與模型對照組、1.5 mg/kg組和0.75 mg/kg組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1.5 mg/kg組與模型對照組和0.75 mg/kg組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），。

2.2 各組凝血功能比較 見表2。模型對照組血小板3H-5HT、凝血酶、內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa的生成增多，CT和BT均進(jìn)一步縮短，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雙香豆素組血小板3H-5HT、凝血酶、內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa的生成減少，CT和BT均延長，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。槲皮素組呈劑量依賴性降低凝血酶、內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa的生成，抑制血小板3H-5HT釋放并延長CT和BT時(shí)間，其中槲皮素3 mg/kg組與模型對照組、1.5 mg/kg組和0.75 mg/kg組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1.5 mg/kg組與模型對照組和0.75 mg/kg組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但槲皮素組對上述指標(biāo)的作用均弱于雙香豆素。

表1 各組靜脈血P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表達(dá)比較（pg/mL，±s）

表1 各組靜脈血P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表達(dá)比較（pg/mL，±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05；與槲皮素 0.75 mg/kg組比較，◇P＜0.05；與槲皮素 1.5 mg/kg組比較，▲P＜ 0.05。下同。

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表2 各組凝血功能比較（±s）

表2 各組凝血功能比較（±s）

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3 討 論

槲皮素又名槲皮黃素、櫟精，大多數(shù)植物的花、葉、果實(shí)中均有以苷形式存在的槲皮素，其中以蘆丁、櫟樹中含量較高。槲皮素具有抗氧化、清除氧自由基活性、對腫瘤具有周期阻滯于G0/M期等作用，還具有抑制炎性介質(zhì)表達(dá)、顯著抑制白血病患者血小板釋放作用［9-11］。

P-selectin是血小板顆粒表面的一種膜蛋白，在生理情況下其較少表達(dá)，但當(dāng)血小板被凝血酶激活后，P-selectin隨即暴露于胞漿表面，發(fā)揮介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、活化血小板與白細(xì)胞的相互作用，并促使內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織因子，啟動凝血反應(yīng)，其水平增加說明體內(nèi)血小板活化程度相應(yīng)增強(qiáng)［12］。ICAM-1和VCAM-1屬于免疫球蛋白，為重要的血管和細(xì)胞間的黏附分子。ICAM-1參與淋巴細(xì)胞的分化，為T淋巴細(xì)胞活化的共刺激信號之一，在免疫效應(yīng)細(xì)胞識別和殺傷方面發(fā)揮增強(qiáng)作用［13-14］。VCAM-1在白細(xì)胞穿越血管壁到達(dá)炎癥部位的過程中發(fā)揮重要作用，并參與細(xì)胞與基質(zhì)相互識別與黏附［15］。故在 ALL 凝血功能中，P-selectin、VCAM-1和ICMA-1相互作用，與ALL的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［16］。在本實(shí)驗(yàn)中，雙抗體夾心法測定顯示槲皮素組呈劑量依賴性降低血小板P-selectin、VCAM-1和ICMA-1蛋白表達(dá)，這提示槲皮素對P-selectin、VCAM-1和ICMA-1均有明顯的抑制作用。槲皮素可能通過抑制P-selectin、VCAM-1和ICMA-1使細(xì)胞與基質(zhì)間黏附力降低，阻止過于活化T/B淋巴細(xì)胞，以減輕其對血管內(nèi)皮的損傷，間接避免因血管內(nèi)皮損傷激活內(nèi)源性凝血引發(fā)DIC。

ALL患者存在B、T或成熟B淋巴細(xì)胞發(fā)生克隆性異常增殖，這些異常活躍的TB淋巴祖細(xì)胞除對肝、脾、淋巴等器官和組織廣泛浸潤外，還會造嚴(yán)重影響到凝血功能，造成出血和凝血異常，患兒短期內(nèi)即可能死亡［17］。體內(nèi)存在有內(nèi)源性及外源性兩種激活系統(tǒng)。前者是指心血管內(nèi)膜受損，或血液流出體外通過與異常表面接觸而激活因子Ⅻ（Hageman factor）。后者則由于組織損傷釋放出因子Ⅲ，從而激活因子Ⅶ。兩者都能啟動一系列連鎖反應(yīng)，并在因子Ⅹ處匯合，最后都導(dǎo)致凝血酶原的激活及纖維蛋白的形成。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體整個凝血過程大致上可分為凝血酶原的激活及凝膠狀纖維蛋白的形成兩個階段。首先，激活的因子Ⅹ與因子Ⅴ、磷脂及Ca2+形成復(fù)合物并將凝血酶原激活為凝血酶。凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，也是血液凝血級聯(lián)反應(yīng)中的主要效應(yīng)蛋白酶，顯現(xiàn)出促凝和抗凝的雙重生物學(xué)特性。凝血酶是由在凝血酶原復(fù)合物中的非活性凝血酶原在凝血因子Xa的作用下通過蛋白裂解的方式產(chǎn)生，當(dāng)循環(huán)凝血因子在暴露的血管外組織與組織因子相接觸時(shí)，凝血酶會在組織上聚集。凝血酶通過激活血小板，催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而產(chǎn)生凝血作用，即外源性凝血被激活［18］。凝血因子Xa刺激后產(chǎn)生了有活性的血小板樣顆粒并促使巨核細(xì)胞分化為血小板［19］。另外，在血栓形成的同時(shí)，血小板釋放3H-5HT、血液凝固因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅻ等多種活性物質(zhì)激活周圍血小板，促進(jìn)血管收縮，促纖維蛋白形成。在本實(shí)驗(yàn)中，槲皮素組呈劑量依賴性降低凝血酶、內(nèi)/外源性凝血因子Xa的生成，抑制血小板3H-5HT釋放并延長CT和BT時(shí)間，說明槲皮素在凝血過程中，通過抑制上述凝血相關(guān)因子的產(chǎn)生而糾正凝血功能障礙，防止DIC的發(fā)生。

總之，槲皮素可能通過抑制P-selectin、VCAM-1和ICMA-1等與血小板和細(xì)胞黏附分子蛋白表達(dá)而降低血小板及細(xì)胞間的黏附性，并通過干預(yù)ALL內(nèi)/外源性凝血而糾正凝血功能障礙，可在一定程度上減弱白血病細(xì)胞的促凝血效應(yīng)。

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