曾潔，成莉鳳，段盛文，馮湘沅，鄭科，劉志遠，周映君，楊琦，劉正初

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

麻類等韌皮纖維在加工利用過程中必須去除麻纖維伴生物，俗稱膠質(zhì)，才能獲得可供利用的纖維［1］。脫膠是為了脫去韌皮纖維中的伴生物，其主要成分為果膠、半纖維素和木質(zhì)素。果膠是一種存在于高等植物細胞壁中的雜多糖，與植物組織中的半纖維素、木質(zhì)素、纖維素和蛋白質(zhì)等相互交聯(lián)［2］。半纖維素是連接木質(zhì)素和纖維素的一類雜聚多糖，廣泛存在于各種植物纖維的細胞壁中。木聚糖和甘露聚糖都屬于半纖維素［3－4］。因此，果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶是生物脫膠的關(guān)鍵酶。與傳統(tǒng)的漚麻和化學(xué)脫膠方法相比，苧麻生物脫膠方法具有“高效、節(jié)能、減排”等優(yōu)勢，是一種環(huán)境友好型加工方式［5－7］。

Dickeya sp.DCE－01是本團隊長期從事麻類等草本纖維生物精制科學(xué)與工程研究選育到的一株“廣譜性”、“高效性”脫膠菌，該菌株胞外分泌果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶，對苧麻、紅麻、黃麻、亞麻、羅布麻、龍須草、麥草等草本纖維原料均能起到很好的脫膠效果，且6 h能獨立完成苧麻脫膠，不需要其他化學(xué)方法后處理補充。其脫膠功能的廣譜性和高效性在國內(nèi)外都處于領(lǐng)先地位［8－9］。

本研究擬通過對DCE－01菌株關(guān)鍵脫膠酶基因（果膠酶基因、甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因）的克隆及表達分析，深入挖掘DCE－01菌株中脫膠酶基因，旨在為研發(fā)高效麻類脫膠酶制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株DCE－01是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所生物加工課題組分離篩選與保存。E.coli BL21，E.coli Top 10菌株和質(zhì)粒pET－28a購自TaKaRa生物公司。

1.2 主要試劑

DNA膠回收試劑盒、細菌基因組抽提試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；rTaq PCR酶、TA連接試劑盒（質(zhì)粒pMD 19－T）、KOD－Plus－高保真PCR試劑盒和T4 ligase試劑盒均購自TOYOBO生物公司；DNA Marker DL 15000和FastDigest內(nèi)切酶均購自Thermo scientific生物公司；卡那霉素、X－gal、IPTG、氨芐青霉素、酵母提取物、瓊脂粉和胰蛋白胨購自 Sigma公司；其余化學(xué)試劑均為分析純級產(chǎn)品。引物合成和核酸測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母提取物0.5%。固體培養(yǎng)基需加1.5%的瓊脂粉［10］。

SOC培養(yǎng)基：胰蛋白胨 2%，NaCl 0.05%，酵母提取物 0.5%，2.5 mmol／L KCl，0.01 mol／L MgCl2和 0.02 mol／L葡糖糖［10］。

活化培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖1%，牛肉膏0.5%［10］。

2 方法

2.1 菌株DCE－01的活化

挑取一環(huán)課題組斜面管保存的DCE－01菌種菌苔接種于5 mL活化培養(yǎng)基中，振蕩懸浮，35℃培養(yǎng)5 h。稀釋涂平板，35℃培養(yǎng)16～18 h。挑取單菌落接種至5 mL LB培養(yǎng)基，35℃，180 r／min震蕩培養(yǎng) 12～16 h，用于基因組 DNA提?。?0］。

2.2 DCE－01菌株基因組DNA提取

采用細菌基因組DNA提取試劑盒抽提DCE－01基因組 DNA，具體操作參照《細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書》。用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA提取質(zhì)量。于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物設(shè)計

根據(jù)菌株DCE－01的基因組DNA序列信息，利用生物信息學(xué)軟件DNAMAN設(shè)計特異引物。

表1 生物脫膠關(guān)鍵酶基因的擴增引物Tab.1 Primers of key genes of bio－degumming enzymes

2.4 PCR擴增DCE－01關(guān)鍵脫膠酶基因

以DCE－01菌株基因組DNA為模板，采用表1的引物和高保真聚合酶 KOD Plus－Neo－進行 PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 5μL，MgSO43μL，F(xiàn)a1 1μL，Ra1 1μL，KOD Plus－DNA聚合酶1μL，基因組DNA 1μL，用無菌ddH2O補充到總反應(yīng)體積為50μL，快速離心混和，參照TOYOBO《KOD－Plus－高保真PCR試劑盒說明書》進行PCR擴增。

2.5 目的片段回收

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切取目的基因片段進行回收，具體步驟參照OMEGA公司的《DNA凝膠回收試劑盒說明書》。

2.6 平末端DNA加A尾

加 A尾反應(yīng)體系為：10×buffer 2μL，dNTPs 3μL，MgCl21μL，rTaq酶0.5μL，PCR產(chǎn) 物13.5μL。72℃ 保溫30 min，電泳，切膠回收加尾產(chǎn)物。

2.7 目的片段的TA連接

參照試劑盒說明進行TA連接，具體步驟如下：

（1）將Solution I溶液與pMD18－T載體等試劑置于冰上融化；

（2）于200μL滅菌反應(yīng)管中依次加入下列反應(yīng)體系：目的DNA片段4.5μL，Solution I 5μL，pMD18－T載體1μL；

（3）輕緩混勻，低速短暫離心使反應(yīng)體系集中于管底，將連接體系置于16℃孵育過夜。

2.8 重組質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

（1）將E.coli Top10感受態(tài)細胞置于冰上融化；

（2）將酶連產(chǎn)物按1∶100的比例加入Top10感受態(tài)細胞中，輕緩混勻，置于冰水中孵育30 min；

（3）取孵育后的混合液，42℃熱激準確反應(yīng)90 s，迅速置于冰上靜置5～10 min；

（4）加入 800μL SOC液體培養(yǎng)基，37℃、180 r／min振蕩培養(yǎng) 90 min；

（5）取 100μL菌液涂布于 LB固體平板上（已加 20μL 20 mg／mL IPTG、40μL 20 mg／mL X－gal、30μL 100 mg／mL Amp），于 37℃過夜培養(yǎng)。

2.9 重組子篩選與鑒定

（1）菌落PCR驗證

從篩選平板上挑取陽性克隆單菌，用10μL無菌雙蒸水溶解懸浮后，取1μL混合菌液用各自目的基因的引物進行PCR擴增，鑒定重組子是否正確［10］。

（2）重組子的酶切鑒定

參照OMEGA公司的《小量質(zhì)粒提取試劑盒說明書》提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Hand III對重組質(zhì)粒進行雙酶切，驗證目的基因片段是否正確。

2.10 高效表達重組菌的構(gòu)建與驗證

用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Hand III分別對重組質(zhì)粒pMD 19－T－P、pMD 19－T－X和pMD 19－T－M及載體pET－28a雙酶切。經(jīng)電泳、切膠、純化，將目的片段與線性的pET－28a載體進行連接，并轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，通過含100μg／mL卡那霉素的LB平板對重組菌進行篩選。挑取典型單菌落于LB培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Hand III對重組質(zhì)粒pET－28a－P、pET－28a－X和pET－28a－M雙酶切，電泳檢測，驗證目的片段是否正確插入。鑒定后的重組質(zhì)粒由上海生工生物公司進行DNA序列測定。

2.11 重組菌的誘導(dǎo)表達與產(chǎn)酶分析

挑取正確插入目的基因片段的重組菌接種于5 mL LB培養(yǎng)液（含100μg／mL卡那霉素）中，37℃、180 r／min過夜培養(yǎng)。取1 mL菌液接種至100 mL LB培養(yǎng)液（含100μg／mL卡那霉素），37℃、180 r／min培養(yǎng)至OD600達到0.4～0.6時，添加 IPTG到終濃度1 mmol／L，放入水浴搖床中，120 r／min，30℃誘導(dǎo)產(chǎn)酶。以未插入目的片段的空載體菌株pET－28a／BL21為對照，與重組菌進行相同處理。

取1 mL菌液10000 r／min離心5 min，收集菌體，用50μL無菌雙蒸水與等體積2×蛋白上樣緩沖液懸浮菌體，沸水浴5 min，離心取上清，用于SDS－PAGE電泳點樣［11－13］。

分別取誘導(dǎo)6、9、12、15、18、21、24 h的發(fā)酵菌液進行超聲破碎，超聲參數(shù)設(shè)置為：強度30%，超聲5 s，間隔5 s，時間30 min［10］。將裂解后的菌體溶液10000 r／min離心10 min，上清液用于酶活力測定。果膠酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶活力測定方法分別參照文獻［14－17］。

3 結(jié)果與分析

3.1 DCE－01菌株基因組DNA提取

由圖1可以看出，檢測到清晰的單一條帶。OD260/OD280值為1.6～1.8，說明該核酸純度較高，可供后續(xù)試驗備用。

3.2 關(guān)鍵酶基因的擴增

以提取的DCE－01基因組DNA為模板，進行果膠酶基因（pel E）、木聚糖酶基因（xyn）和甘露聚糖酶基因（man）的PCR擴增。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，由圖2可知，該PCR產(chǎn)物條帶清晰、無雜帶，基因片段大小為1000～1300 bp，與預(yù)測結(jié)果一致。經(jīng)測序分析，果膠酶基因片段為1179 bp、木聚糖酶基因片段為1251 bp、甘露聚糖酶基因片段為1137 bp。初步說明關(guān)鍵酶基因擴增成功。

圖1 DCE－01基因組DNAFig.1 Genomic DNA of DEC－01 strain

圖2 關(guān)鍵酶基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of key enzyme gene

3.3 TA克隆重組子篩選與鑒定

將PCR擴增得到的目的基因片段加 A尾，再與pMD 19－T進行TA連接，導(dǎo)入E.coli Top10受體，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pMD 19－T－P、pMD 19－T－X和pMD 19－T－M。對陽性克隆進行菌落PCR，圖3結(jié)果表明：1200 bp附近出現(xiàn)單一清晰的條帶，條帶大小與關(guān)鍵酶基因擴增結(jié)果和預(yù)計基因片段大小基本一致。說明3種關(guān)鍵脫膠酶基因片段成功連接到了pMD 19－T載體上。

對PCR驗證后的重組菌提質(zhì)粒，雙酶切驗證，電泳檢測結(jié)果見圖4。通過雙酶切獲得兩條清晰單一條帶，分別為線性載體pMD 19－T與目的基因片段。線性載體pMD 19－T片段約2600 bp，目的基因片段在1000～1300 bp附近，與預(yù)計DNA片段大小一致，說明重組子構(gòu)建成功。

圖3 菌落PCR檢測重組子Fig.3 Detection of recombinants by PCR

圖4 酶切檢測重組子Fig.4 Detection of recombinants

3.4 高效表達重組菌的鑒定與產(chǎn)酶分析

經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建重組菌 pET－28a－P／BL21、pET－28a－X／BL21和 pET－28a－M／BL21。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Hand III對重組子進行酶切驗證，酶切鑒定電泳檢測結(jié)果見圖5。通過雙酶切獲得兩條清晰單一條帶，分別為 pET－28a線性空載體與目的基因片段。線性載體pET－28a約5000 bp，目的片段條帶在1000～3000 bp，與預(yù)計片段大小一致。

圖5 酶切檢測重組子Fig.5 Detection of recombinants

將構(gòu)建的重組菌株誘導(dǎo)表達后進行SDS－PAGE電泳，檢測蛋白表達量，以未插入目的片段的空載體菌株pET－28a／BL21為對照，與重組菌進行相同處理，結(jié)果（見圖6）可看到明顯表達條帶，其表觀分子量與預(yù)測的帶有部分載體的融合蛋白分子量接近，即果膠酶（pel E）、木聚糖酶（xyn）、甘露聚糖酶（man）蛋白的表觀分子量分別為43.8、45.7、41.8 kDa。由此可見，從DCE－01菌株中克隆出來的3個關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)化至菌株pET－28a／BL21中均達到了特異性表達的效果。

圖6 SDS－PAGE檢測親本酶、多基因重組菌株表達Fig.6 Expression of parent enzyme and multiple gene recombinant strains by SDS－PAGE

以未插入目的片段的空載體菌株pET－28a／BL21為對照，與重組菌進行相同處理。分別對重組菌pET－28a－P／BL21、pET－28a－X／BL21和 pET－28a－M／BL21進行誘導(dǎo)表達，測定不同誘導(dǎo)時間的酶活，結(jié)果（見圖7～9）發(fā)現(xiàn)3種酶酶活均較高，尤其以果膠酶和甘露聚糖酶最為明顯，果膠酶酶活最高達471.97 U／mL，甘露聚糖酶則達到16882.86 U／mL。

圖7 不同誘導(dǎo)時間的果膠酶活力Fig.7 Activity of pectinase in different induction time

圖8 不同誘導(dǎo)時間的木聚糖酶活力Fig.8 Activity of xylanase in different induction time

圖9 不同誘導(dǎo)時間的甘露聚糖酶活力Fig.9 Activity ofβ－mannanase in different induction time

4 結(jié)論與討論

通過對廣譜性高效脫膠菌株DCE0－1的關(guān)鍵性脫膠酶基因的研究，成功獲得了高效表達果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶的重組菌pET－28a－P／BL21、pET－28a－M／BL21和pET－28a－X／BL21。經(jīng)酶活測定，果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶活力分別高達471.97、16882.86、64.32 U／mL。

與其他報道相比，本研究構(gòu)建的甘露聚糖酶重組菌pET－28a－M／BL21具有明顯優(yōu)勢。楊家興［18］在β－甘露聚糖酶在黑曲霉中的表達研究中報道的粗酶液的最高酶活為521 U／mL；張立霞［19］在硫色曲霉來源的β－甘露聚糖酶的異源表達及酶學(xué)性質(zhì)研究中報道的甘露聚糖酶的產(chǎn)量為587 U／mL；劉項羽等［20］關(guān)于β－甘露聚糖酶基因在枯草芽孢桿菌中的克隆及表達中報道的酶活力最高為2748.82 U／mL。本研究中構(gòu)建的甘露聚糖酶表達菌株比上述報道的菌株甘露聚糖酶活力高14～31倍，為脫膠用甘露聚糖酶制劑的開發(fā)利用奠定了良好的基礎(chǔ)。

本團隊后續(xù)將會對基因工程菌種產(chǎn)酶的誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)劑濃度、時間、溫度等）進一步優(yōu)化，也將對基因工程菌種所產(chǎn)的果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶進行純化及末端氨基酸肽段測序（或western blot分析），驗證SDS－PAGE圖譜中的目標蛋白即為對應(yīng)的脫膠關(guān)鍵酶蛋白。

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