孫宇桐，鄒琪琪，孫菊鮮，孫曉宇，齊姍姍，辛 琪，葛 欣(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

甲基營養(yǎng)菌是一種廣泛存在的微生物，它能夠?qū)⒁惶蓟衔镒鳛槲ㄒ坏奶荚春湍茉?。Methylocorussp. MP 688是從土壤中篩選到的一株高產(chǎn)吡咯喹啉醌細(xì)菌，能夠以甲醇為唯一碳源生長。吡咯喹啉醌是在細(xì)菌中繼煙酰胺和黃酮之后的第3個氧化還原因子，菌株MP 688作為重要的吡咯喹啉醌生產(chǎn)菌在工業(yè)上有著重要的經(jīng)濟(jì)價值[1-4]。因此，本文通過分析菌株MP688的基因組信息及代謝途徑，來探究菌體代謝活動中絲氨酸循環(huán)對于細(xì)胞生命活動所起的作用，無疑會對今后進(jìn)一步改造菌體代謝通路起到重要的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

MP688野生型菌種、質(zhì)粒pGX為本實驗室保存；大腸埃希菌DH 5α及BL 21感受態(tài)、質(zhì)粒pET-15b、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒、普通質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生物公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等購自博邁德生物公司；考馬斯亮藍(lán)試劑、牛血清白蛋白溶液購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無縫克隆試劑盒(ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit)購自Vazyme公司；測序及PCR引物合成由奧科鼎盛公司完成。

MP培養(yǎng)基。硫酸鎂0.2 g·L-1，硫酸銨3 g·L-1，磷酸二氫鉀1.4 g·L-1，磷酸氫二鈉3 g·L-1，檸檬酸鐵0.03 g·L-1，氯化鈣0.03 g·L-1，氯化錳0.005 g·L-1，硫酸鋅0.005 g·L-1，硫酸銅0.005 g·L-1，甲醇10 mL，pH值6.8。

逆向酶活底物反應(yīng)液配置。DL-苯基絲氨酸(100 mmol·L-1) 25 mL，磷酸吡哆醛 100 μL(25 mmol·L-1)，Na2EDTA(100 mmol·L-1) 500 μL，Na2SO4(250 mmol·L-1) 5 mL，K2HPO4-KH2PO4(pH 7.6) 5 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.6，ddH2O定溶至50 mL。

1.2 SHMT蛋白體外表達(dá)及純化方法

1.2.1glyA基因的克隆及pET15b-glyA質(zhì)粒構(gòu)建

登錄GenBank查找菌株MP 688的glyA基因序列(NC014733)，該開放閱讀框編碼一條由415個氨基酸組成的肽鏈，預(yù)測分子量為44.4 ku。通過Primer 5設(shè)計了一對寡聚核苷酸引物，序列見表1?；蚪M提取、PCR、酶切、連接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學(xué)操作按照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。使用質(zhì)粒pET-15b作為glyA基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL 21感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.2glyA基因誘導(dǎo)表達(dá)

SHMT酶的表達(dá)、純化。按照1%接種量將轉(zhuǎn)化入pET15b-glyA質(zhì)粒的BL 21感受態(tài)接入100 mL含有氨芐青霉素100 μg·mL-1的液體LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r·min-1搖床培養(yǎng)至菌濃度為D=0.6時，加入IPTG終濃度1 mmol·L-1，16 ℃，100 r·min-1誘導(dǎo)表達(dá)12～16 h。隨后，將全部培養(yǎng)物經(jīng)10 000 r·min-1離心10 min。使用裂解緩沖液重懸菌體，超聲破碎菌體，5 min，將破碎后菌體4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min。將上清與處理好的Ni螯合Chelating-Sepharose樹脂混勻，4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床緩搖1 h；4 ℃，500g離心3 min，輕去上清，收集樹脂珠粒；加入5 mL含低濃度咪唑洗脫液，4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床緩搖10 min，洗脫雜質(zhì)；4 ℃，500g離心3 min, 輕去上清，收集樹脂珠粒，重復(fù)洗滌3次；再將1 mL洗脫液加入樹脂中，充分混合后離心，上清液中應(yīng)含有高濃度目的蛋白；電泳檢測各組分，考察純化效果。

SHMT酶保存條件：4 ℃透析除鹽，每隔8 h更換一次透析液，逐漸降低透析液中的鹽離子濃度，透析后的蛋白溶液加入終濃度為5%甘油，-20 ℃保存。

1.2.3 SHMT酶活測定

BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mg·mL-1依次進(jìn)行梯度稀釋，取同樣體積稀釋液加入等體積的考馬斯亮藍(lán)溶液，每個梯度做3個平行并與96孔板中進(jìn)行波長為595 nm吸光值檢測，記錄數(shù)值，并繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取苯甲醛母液(10 mmol·L-1)10 μL溶于10 mL ddH2O中，避光保存。將其依次進(jìn)行梯度稀釋，取同樣的稀釋液加入等體積的考馬斯亮藍(lán)溶液，每個梯度做3個平行并與96孔板中進(jìn)行波長為275 nm吸光值檢測，記錄數(shù)值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

最適酶促反應(yīng)條件實驗及逆向酶活測定。在35 ℃條件下測定最佳酶促反應(yīng)pH，分別使用磷酸緩沖液(pH值5.0～7.0)、Tris-HCl緩沖液(pH值7.5～8.5)作為緩沖體系。在pH 7.0條件下檢測最適反應(yīng)溫度，范圍為25～60 ℃。將最高酶活定義為100%，然后分別計算其他條件下的相對酶活，繪制pH/溫度-相對酶活性曲線，以確定酶的最適pH值或溫度。

逆向酶活測定。測定純化后的酶蛋白濃度，再將1 μg酶蛋白加入1 mL底物溶液[6-10]，最適溫度及pH值條件下避光反應(yīng)1 h，測定D275數(shù)值并記錄。將SHMT酶活力單位定義為：1 μg SHMT酶35 ℃避光反應(yīng)1 h條件下，轉(zhuǎn)化生成1 μmol·L-1的苯甲醛所具有的酶活力，稱為一個酶活力單位(IU，又稱U)。

1.3 雙交換系統(tǒng)glyA的敲除

1.3.1 敲除載體pGX-up-Gm-down構(gòu)建

引物up-F、up-R用于擴(kuò)增基因glyA的上游同源臂，引物down-F、down-R用于擴(kuò)增基因glyA的下游同源臂；使用雙交換敲除法進(jìn)行敲除實驗，以慶大霉素(Gm)為敲除標(biāo)記。Gm-F，Gm-R引物用來擴(kuò)增慶大霉素抗性基因。使用Vazyme公司無縫克隆試劑盒將片段和敲除載體pGX線性化質(zhì)粒相連。引物序列及酶切位點見表1。

表1 引物序列的基本情況

1.3.2 雙交換glyA基因敲除

將pGX-up-Gm-down質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入MP688菌株中, 將其均勻涂布于以添加果糖(20 mmol·L-1)及慶大霉素(50 μg·mL-1)的MP固體培養(yǎng)基(FGMP)上，28 ℃培養(yǎng)3 d。挑取單菌落，轉(zhuǎn)接FGMP液體試管2～3 mL，30 ℃搖床培養(yǎng)2 d。生長的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接添加果糖(20 mmol·L-1)及卡那霉素(50 μg·mL-1)的MP液體培養(yǎng)基(FKMP)中，若在FGMP中生長且在FKMP中不長，則為通過雙交換法成功構(gòu)建的glyA基因缺失菌。此外，還通過更換不同的碳源如甲醇來篩選敲除子。

2 結(jié)果與分析

2.1 glyA基因體外表達(dá)

2.1.1 pET15b-glyA質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)

我們使用primer premier 5.0軟件設(shè)計glyA基因引物，擴(kuò)增得到完整的glyA基因，將其成功連接到表達(dá)質(zhì)粒上，PCR驗證結(jié)果及雙酶切結(jié)果見圖1。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法成功構(gòu)建大腸埃希菌BL 21轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)加入誘導(dǎo)物的培養(yǎng)物在42.5 ku大小處條帶明顯加粗，蛋白電泳圖片見圖2。

1為Marker；2為雙酶切驗證；3為glyA 基因；4為空載酶切；5為環(huán)狀質(zhì)粒圖1 pET-15b-glyA質(zhì)粒構(gòu)建驗證

1為Marker; 2為未誘導(dǎo); 3～4為誘導(dǎo)圖2 IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化子表達(dá)SHMT蛋白電泳結(jié)果

2.1.2 SHMT蛋白表達(dá)及純化

根據(jù)膠圖發(fā)現(xiàn)42.5 ku蛋白為雙帶。由此得出兩個猜想：SHMT蛋白被水解破壞；SHMT蛋白上樣緩沖液處理在變性過程中未能完全將其還原，其中含有兩個或多個半胱氨酸，因此出現(xiàn)兩種結(jié)構(gòu)。為驗證猜想的正確性，我們登錄NCBI查找MP 688表達(dá)的SHMT氨基酸序列，分析其氨基酸序列及組成。由于SHMT序列在68及165位置處為半胱氨酸，可能導(dǎo)致分子內(nèi)或分子間形成二硫鍵，序列如圖3。進(jìn)一步導(dǎo)致純化的蛋白出現(xiàn)如圖4中條帶3～5的雙帶。因此，再次進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并在上樣前補(bǔ)加β-ME，電泳結(jié)果見圖5，從而解決了非均一條帶的問題。

圖3 SHMT氨基酸序列

1為Marker; 2為破碎菌體; 3～5為純化蛋白圖4 SHMT蛋白純化電泳結(jié)果

1為Marker; 2為破碎菌體; 3～5為純化蛋白圖5 還原SHMT蛋白電泳結(jié)果

2.2 SHMT蛋白的酶活力

2.2.1 蛋白含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

記錄梯度稀釋BSA蛋白D595吸光值并使用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6。

圖6 蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 純化后蛋白濃度

使用合適稀釋梯度的純化蛋白溶液加入考馬斯亮藍(lán)溶液，做3個平行并于96孔板中進(jìn)行波長為595 nm吸光值檢測，平均吸光值為0.018 4。代入BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程式中計算，得出蛋白濃度為0.1 g·L-1。

2.2.3 苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

苯甲醛母液(10 mmol·L-1)：10 μL溶于10 mL ddH2O中，避光保存。記錄苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)，使用Excel繪制苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖7。

圖7 苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4 逆向酶活力

測定不同溫度或不同pH條件下的酶促反應(yīng)速率，記錄數(shù)值并計算在不同條件下的相對酶活力，繪制柱狀圖，如圖8及圖9。得出SHMT酶最適反應(yīng)pH值為7.5，最適催化溫度35～40 ℃。因此，后續(xù)實驗選擇在pH 值7.5的條件下，35 ℃反應(yīng)1 h測定D275處的吸光值，并計算酶活。

圖8 pH值對SHMT酶活力影響

結(jié)合SHMT酶一級結(jié)構(gòu)序列，引發(fā)我們探究還原及非還原狀態(tài)對酶活性的影響。我們在測定逆向酶活的同時，梯度添加β-巰基乙醇(β-ME)為實驗組，正常不添加還原劑的反應(yīng)組為對照組，分別做3組平行測定SHMT逆向酶活力，將1 μg酶蛋白加入1 mL底物溶液(pH值7.5)中，35 ℃ 避光反應(yīng)1 h，測定D275。測定結(jié)果見表2。

圖9 溫度對SHMT酶活力影響

表2 苯甲醛的吸光值

注：β-ME影響吸光值，所以梯度添加β-ME時，應(yīng)該以加β-ME的底物反應(yīng)液為空白對照調(diào)0。

根據(jù)酶活定義可以得出1 μg SHMT酶在正常催化條件下的酶活力為30.4 IU，在添加β-ME的純化條件下酶活力為48.3 IU。

2.3 glyA敲除質(zhì)粒構(gòu)建

2.3.1glyA敲除

通過GenBank中查找到glyA基因上下游各1 500 bp左右的片段及慶大抗性基因通過無縫克隆設(shè)計相關(guān)引物并成功擴(kuò)增出3個條帶，使用pGX質(zhì)粒作為載體，成功構(gòu)建出glyA敲除質(zhì)粒。敲除質(zhì)粒構(gòu)建及雙酶切驗證見圖10。

a為擴(kuò)增片段(1表示DNA marker，2表示Up片段，3表示Gm片段，4表示down片段; 5表示glyA片段)；b為pGX-glyA重組敲除質(zhì)粒；c為敲除質(zhì)粒雙酶切驗證圖圖10 pGX-glyA敲除質(zhì)粒構(gòu)建及雙酶切驗證

2.3.2 敲除結(jié)果

電轉(zhuǎn)野生型MP 688感受態(tài)細(xì)胞，將其均勻涂布于FGMP固體平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d。反復(fù)挑取單菌落，接FGMP液體試管2～3 mL，30 ℃搖床培養(yǎng)。2 d后，生長的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接FKMP液體培養(yǎng)基。通過更換不同的碳源如甲醇，代替果糖進(jìn)行敲除子篩選實驗。由于反復(fù)篩選敲除子，我們得到多株可在添加慶大霉素的MP培養(yǎng)基中生長的菌株，始終未得到缺失型菌株。

3 討論

我們成功將MP688菌株glyA基因在體外表達(dá)、純化并測定SHMT酶活性。在純化蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)，合理地添加β-ME可以使酶處于還原狀態(tài)并維持均一的空間結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)相同的實驗條件下，在酶促反應(yīng)體系中添加β-ME，可大幅增加苯甲醛產(chǎn)量。依據(jù)本文酶活力單位的定義，我們可以得出，在相同的實驗條件下，添加β-ME的酶促反應(yīng)體系可顯著增強(qiáng)SHMT酶催化效率。

由于反復(fù)篩選敲除子，并沒有得到缺失型菌株。分析MP 688菌株代謝途徑，參考報道的MethylobacteriumextorquensAM 1菌株代謝模塊見圖11[6]。細(xì)菌菌體代謝有機(jī)碳源為菌體生長代謝提供必需的能量，同化C1單位促進(jìn)菌體生長繁殖。通常菌株經(jīng)糖酵解途徑后到達(dá)絲氨酸循環(huán)及檸檬酸循環(huán)實現(xiàn)C1單位利用。菌株MP 688與AM 1代謝途徑存在巨大差異，可發(fā)現(xiàn)菌株MP 688基因組較AM 1所含信息量少。

圖11 菌株Methylobacterium extorquens AM1的C1同化通路

菌株MP 688檸檬酸循環(huán)通路不完整，缺少草酰琥珀酸向琥珀酸-CoA轉(zhuǎn)化的酶及琥珀酸向延胡索酸轉(zhuǎn)化的酶基因。菌株MP 688沒有完整的檸檬酸途徑及絲氨酸循環(huán)途徑，C1同化由SHMT酶催化完成，必將通過其他代謝通路來形成環(huán)形通路。

在MP688菌株基因組中發(fā)現(xiàn)能夠催化絲氨酸-甘氨酸之間相互轉(zhuǎn)化的基因只有g(shù)lyA基因一種。因此，我們推測glyA基因在菌體固定C 1單位中作為關(guān)鍵基因存在，起到不可替代的作用。一旦缺失，菌株將會致死。這為后一步改造該菌種，構(gòu)建吡咯喹啉醌高產(chǎn)菌株具有十分重要的意義。

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