尚振華 賈春松 顏 灝 王巨昆 王 旭 崔 波 王 琦 歐彤文

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院泌尿外科，北京 100053)

膀胱平滑肌的副交感神經(jīng)調(diào)控主要通過神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿作用于膀胱平滑肌細胞(bladder smooth muscle cells，BSMCs)的乙酰膽堿受體發(fā)揮作用。乙酰膽堿M型受體分為5型而BSMCs主要表達M2和M3型[1]。雖然M2受體在數(shù)量上明顯多于M3受體，但是M2受體通過抑制交感神經(jīng)β受體介導(dǎo)的膀胱舒張功能而間接發(fā)揮收縮膀胱的作用[2-3]，而M3受體直接介導(dǎo)膀胱的收縮功能[4-7]。小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)通常含有21～25個核苷酸，它通過與Dicer 酶等復(fù)合物的一系列生物化學(xué)酶學(xué)反應(yīng)降解同源序列mRNA[8]從而發(fā)揮抑制基因的翻譯、下調(diào)目的基因表達的作用。目前廣泛應(yīng)用的siRNA慢病毒載體是以人類免疫缺陷1型病毒(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)為基礎(chǔ)構(gòu)建的，siRNA慢病毒載體與具有病毒包裝輔助功能的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T 細胞后可以獲得靶基因的siRNA慢病毒。慢病毒攜帶siRNA可以穩(wěn)定、高效、持續(xù)地干擾靶細胞目的基因的翻譯過程從而達到下調(diào)目的蛋白表達的目的。由于M3受體在膀胱平滑肌收縮中起主要作用，因此，選擇M3受體作為干擾靶點。

本研究擬通過體外原代培養(yǎng)BSMCs，構(gòu)建M3受體siRNA慢病毒載體，研究siRNA干擾M3受體表達的效果，為下一步探索M3受體基因干擾抑制神經(jīng)源性膀胱患者膀胱過度活動和纖維化的可能性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性Wistar大鼠(220～250 g)，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2017-0033，北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動物中心SPF級動物房。293T細胞，pHelper 1.0、pHelper 2.0質(zhì)粒及重組載體GV118購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、Ⅳ型膠原酶和青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 體外原代培養(yǎng)大鼠BSMCs

脫頸法處死Wistar大鼠，75%(體積分數(shù))乙醇浸泡5 min，下腹正中切口從膀胱頸部切下膀胱，超凈臺內(nèi)用100 U/mL慶大霉素浸泡5 min，再在PBS溶液中將黏膜層、黏膜下層和漿膜層除去。將肌層盡可能剪碎后置于0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰酶中37 ℃震蕩消化30 min，1 000 r/min離心5 min，將沉淀置于0.1%(質(zhì)量分數(shù))Ⅳ型膠原酶中37 ℃震蕩消化30 min。100 目細胞篩過濾后1 000 r/min離心5 min，用含15%(體積分數(shù))胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀的細胞，將細胞移入25 mL培養(yǎng)瓶并置于5%(體積分數(shù))CO2、37 ℃飽和濕度的孵育箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2 d更換一次。BSMCs增生達到約80%融合時按1∶4的比例進行傳代。

1.2.2 GV118-sh-M3載體構(gòu)建及病毒制備

設(shè)計4條siRNA干擾靶點如下。M3target 1: GGAAAGAAGGAGAGGCATA；M3target 2:GCAACAGCAAGGCGTGAAA；M3target 3:GGCAATACTTTGTAGGGAA；M3target 4: ACAAACAGCTGAAGACAGT并合成下列寡核苷酸鏈，詳見表1。

表1 siRNA干擾序列Tab.1 siRNA sequence

引物溶于緩沖液中90 ℃水浴15 min，冷卻退火配對產(chǎn)生雙鏈。陰性對照(negative control，NC)慢病毒載體的序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切慢病毒載體GV118后與退火產(chǎn)物連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，氨芐西林篩選陽性克隆并測序驗證。測序驗證后分別命名為GV118-sh-M3-1(KD1)、GV118-sh-M3-2(KD2)、GV118-sh-M3-3(KD3)、GV118-sh-M3-4(KD4)和NC-sh-M3(NC)。利用Lipofectamine 2000將pHelper 1.0、pHelper 2.0及4種GV118-sh-M3和NC-sh-M3載體分別共轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的293T細胞，培養(yǎng)8 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌后加入培養(yǎng)基25 mL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集293T細胞上清液在4 ℃離心機4 000 g離心10 min。0.45 μm濾器過濾上清后將病毒提取液移入過濾杯中，4 000 g離心10 min，再將過濾杯倒扣在收集杯上800 g離心2 min，收集杯中即為病毒濃縮液。

1.2.3 熒光法測定滴度

將293T細胞種于96孔板，每個孔細胞數(shù)為4×104個，體積為100 μL。準備8個無菌EP管，每個管加入90 μL無血清培養(yǎng)基。將病毒液10 μL加到第1個管，混勻后取10 μL加到第2個管，繼續(xù)相同操作直到最后一個EP管。選取細胞孔，將90 μL培養(yǎng)基棄掉加入90 μL EP管中稀釋的病毒溶液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入完全培養(yǎng)基100 μL，4 d后觀察熒光蛋白表達情況。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染BSMCs

將5×104的BSMCs懸液接種于12孔板，培養(yǎng)至細胞融合度約為30%。取干擾病毒和NC病毒加入12孔板孔內(nèi)。每個孔干擾病毒感染復(fù)數(shù)(multiply of infection，MOI)值，分別為30、10、l2和12，將未轉(zhuǎn)染BSMCs作為空白對照。感染12 h后更換培養(yǎng)基，感染24 h后熒光顯微鏡下觀察細胞感染狀況。

1.2.5 RT-PCR檢測M3受體mRNA

收集上述BSMCs，分別提取總RNA，然后進行RT-PCR，M3受體的上游引物為5′-GGCTACTGGCTGTGCTATATC-3′， 下游引物為5′-TCTTGAAGGTGGTTCTGAATGT-3′。磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的上游引物為5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′， 下游引物為5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′。兩步法進行RT-PCR并制作熔解曲線。根據(jù)各組M3mRNA和GAPDH的原始ct值，2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 Western blotting法檢測M3受體蛋白表達

收集上述BSMCs, 細胞裂解后離心取沉淀，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，用 5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉封閉4 ℃過夜，M3一抗(1∶1 000)37 ℃溫育2 h，用含0.5% (體積分數(shù))Tween-20的Tris-HCl緩沖液(Tris buffered saline tween，TBST)洗滌 3 次,每次10 min,二抗(1∶2 000)37 ℃溫育1 h，TBST洗滌 3 次,每次10 min, 加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進行膠片曝光顯影，Image Pro Plus進行灰度統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果

重組載體測序結(jié)果，其干擾序列的峰形圖均為單峰，無突變，說明在重組載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中序列符合設(shè)計序列，詳見圖1。

圖1 基因測序Fig.1 Gene sequencing

A: recombinant vector KD1；B: recombinant vector KD2；C: recombinant vector KD3；D: recombinant vector KD4；KD1: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD1 group;KD2: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD2;KD3: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD3;KD4: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD4；BSMCs： bladder smooth muscle cells.

2.2 慢病毒滴度測定

熒光法測病毒滴度， NC、KD1、KD2、KD3和KD4滴度分別為8×108、2×108、6×108、5×108和5×108TU/mL。

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染BSMCs

未轉(zhuǎn)染BSMCs、陰性病毒和干擾病毒轉(zhuǎn)染BSMCs組熒光蛋白表達量， KD1組熒光蛋白表達量最高，詳見圖2。

圖2 各組BSMCsFig.2 BSMCs in each group (100×)

A:blank control group;B: negative control group;C: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD1 group;D: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD2;E: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD3;F: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD4;BSMCs:bladder smooth muscle cells.

2.4 RT-PCR檢測M3受體mRNA

RT-PCR所得各組相對mRNA水平，KD1組M3受體基因干擾效率達到78.9%，為最符合要求的有效靶點，詳見圖3。

2.5 Western blotting法檢測M3受體蛋白相對表達量

Western blotting測得各組細胞M3受體蛋白相對表達量，KD1組M3受體表達量最低，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖4。

3 討論

膀胱在儲尿期的調(diào)控主要是交感神經(jīng)在發(fā)揮作用，交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素作用于BSMCs的β3受體而使其舒張并作用于膀胱頸口平滑肌的α1受體使其收縮[9-10]；而副交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)纖維釋放的乙酰膽堿通過作用于BSMCs的M2和M3受體而使膀胱平滑肌收縮[11]。但是M2受體通過抑制交感神經(jīng)β受體介導(dǎo)的膀胱舒張而間接發(fā)揮收縮膀胱的作用[2-3]，而M3受體直接介導(dǎo)膀胱的收縮[4-7]。M3受體是由CHRM3基因編碼的乙酰膽堿毒蕈堿型受體[12]，毒蕈堿型受體主要介導(dǎo)內(nèi)臟器官平滑肌和上皮的神經(jīng)調(diào)控，包括呼吸道、胃腸道和泌尿道[13]。毒蕈堿型受體分為具有不同的功能的5個類型M1～M5。M3受體與Gq蛋白偶聯(lián)發(fā)揮作用，當乙酰膽堿作用于M3受體時，M3受體與Gq蛋白的偶聯(lián)導(dǎo)致磷酸肌醇水解產(chǎn)生三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3)和前列腺素(prostaglandin，PG)，IP3和PG作為信使介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流從而導(dǎo)致逼尿肌收縮[14-15]。

圖3 各組相對mRNA水平Fig.3 mRNA expression of M3 in each group

圖4 各組M3受體蛋白相對表達量Fig.4 Protein expression of M3 in BSMCs in each group

慢病毒為目前常用的基因運輸載體，具有諸多優(yōu)點[16-17]。首先，慢病毒載體具有較高的感染效率，它不僅可以感染分裂細胞，還可以感染非分裂細胞。本研究構(gòu)建的慢病毒載體干擾效率為78.9%，國內(nèi)其他研究[18-21]也取得較高的干擾效率，而反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染效率不及慢病毒[22]。其次，慢病毒載體作用穩(wěn)定且時間長[23]，它可以攜帶目的基因穩(wěn)定的整合進基因組。研究比較了慢病毒載體、腺病毒載體等轉(zhuǎn)染靶細胞后作用時間，結(jié)果顯示腺病毒載體作用時間明顯短于慢病毒載體[22-24]；而且慢病毒載體免疫源性低而具有很好的安全性。慢病毒為剔除毒性基因的假病毒，感染靶細胞后不會再產(chǎn)生新的病毒顆粒。

本研究中慢病毒載體所攜帶的為M3受體siRNA序列。siRNA通過與Dicer 酶等復(fù)合物的一系列生物化學(xué)酶學(xué)反應(yīng)降解同源序列mRNA[8]。本研究中慢病毒載體為GV118 載體，GV118載體含有HIV基本元件5′LTR和3′LTR以及其他輔助元件，帶有綠色熒光蛋白基因和puro 抗性基團標記；pHelper 1.0中含有分別編碼HIV病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白、病毒特異性酶和調(diào)節(jié)gag和pol基因表達調(diào)節(jié)因子的基因；pHelper 2.0含有編碼包膜蛋白的基因[25]?；驕y序結(jié)果顯示M3受體siRNA序列成功插入GV118 載體并利用Lipofectamine 2000 系統(tǒng)收獲慢病毒。熒光法測得病毒滴度后轉(zhuǎn)染BSMCs，通過綠色熒光蛋白表達量以及RT-PCR檢測選取干擾效率最高的KD1組病毒進行后續(xù)實驗。

綜上所述，成功包裝并篩選了GV118-sh-M3慢病毒顆粒，為后續(xù)進一步研究干擾M3型受體在神經(jīng)源性膀胱中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1] Lin C S, Wu T T, Chang C H, et al. Changes of bladder M1,3muscarinic receptor expression in rats fed with short-term/long-term high-fat diets[J]. Low Urin Tract Symptoms,2017，[Epub ahead of print].

[2] Berndt-Paetz M, Herbst L, Weimann A, et al. Highly specific detection of muscarinic M3 receptor, G protein interaction and intracellular trafficking in human detrusor using Proximity Ligation Assay (PLA)[J].Acta Histochem, 2018,[Epub ahead of print].

[3] Liu Q, Luo D Y, Yang T, et al. Protective effects of antimuscarinics on the bladder remodeling after bladder outlet obstruction[J].Cell Physiol Biochem, 2017, 44(3): 907-919.

[4] Giglio D, Podmolikova L, Tobin G. Changes in the neuronal control of the urinary bladder in a model of radiation cystitis[J].J Pharmacol Exp Ther, 2018,365(2):327-335.

[5] Ehrhardt A, Wang B, Yung A C, et al. Urinary retention, incontinence, and dysregulation of muscarinic receptors in male mice lacking mras[J].PLoS One, 2015, 10(10): e0141493.

[6] Wang C T, Chen T M, Mei C T, et al. The functional haplotypes of modulate mRNA expression and associate with bladder cancer among a Chinese han population in kaohsiung city[J].Biomed Res Int, 2016, 2016: 4052846.

[7] Di Salro J, Nagabukuro H, Wickham L A, et al. Pharmacological characterization of a novel beta 3 adrenergic agonist, vibegron: evaluation of antimuscarinic receptor selectivity for combination therapy for overactive bladder[J].J Pharmacol Exp Ther, 2017, 360(2): 346-355.

[8] Dong X, Liu A, Zer C, et al. siRNA inhibition of telomerase enhances the anti-cancer effect of doxorubicin in breast cancer cells[J]. BMC Cancer,2009,9:133.

[9] Fowler C J, Griffiths D, de Groat W C. The neural control of micturition[J]. Nat Rev Neurosci, 2008,9(6):453-466.

[10] Hannan J L, Powers S A, Wang V M, et al. Impaired contraction and decreased detrusor innervation in a female rat model of pelvic neuropraxia[J]. Int Urogynecol J, 2017,28(7):1049-1056.

[11] Hirose H, Aoki I, Kimura T, et al. The subtypes of muscarinic receptors for neurogenic bladder contraction in rats[J]. Eur J Pharmacol, 2002,452(2):245-253.

[12] Weber S, Thiele H, Mir S, et al. Muscarinic acetylcholine receptor M3 mutation causes urinary bladder disease and a prune-belly-like syndrome[J]. Am J Hum Genet, 2011,89(5):668-674.

[13] Jositsch G, Papadakis T, Haberberger R V, et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2009,379(4):389-395.

[14] Somogyi G T, de Groat W C. Function, signal transduction mechanisms and plasticity of presynaptic muscarinic receptors in the urinary bladder[J]. Life Sci, 1999,64(6-7):411-418.

[15] Igawa Y. Discussion: functional role of M(1), M(2), and M(3) muscarinic receptors in overactive bladder[J]. Urology, 2000,55(5A Suppl):47-49; discussion 50.

[16] 房超， 尹晶，于秋爽，等.慢病毒介導(dǎo)的靶向干擾MEX3A基因膀胱癌穩(wěn)定細胞株的建立[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017,38(12)：1057-1061,1066.

[17] 朱圣韜, 孫秀靜, 李鵬,等. PHF8基因?qū)κ彻荀[狀細胞癌裸鼠移植瘤生長的影響[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2016, 37(1):12-16.

[18] 楊洋, 鄭軍, 徐江,等. Naa10基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其對口腔鱗癌細胞生長的影響[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究，2017(7):707-711.

[19] 孫達權(quán), 羅福麗, 廖美, 等. HuR基因的慢病毒干擾載體構(gòu)建及其病毒包裝[J]. 貴州醫(yī)藥，2017(6):563-565，673.

[20] 莫柒艷, 陳龍, 李齡, 等. 慢病毒介導(dǎo)的靶向干擾PARP-1基因乳腺癌穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建[J]. 中國癌癥防治雜志，2017，9(2):129-133.

[21] 程玉霜, 王慧艷, 肖東. 慢病毒介導(dǎo)RNA干擾HES1鼻咽癌穩(wěn)定細胞株的建立與鑒定[J]. 山東醫(yī)藥， 2017，57(18):9-11.

[22] Gagnoux-Palacios L, Hervouet C, Spirito F, et al. Assessment of optimal transduction of primary human skin keratinocytes by viral vectors[J]. J Gene Med， 2005,7(9):1178-1186.

[23] Lawson S K, Dobrikova E Y, Shveygert M, et al. p38alpha mitogen-activated protein kinase depletion and repression of signal transduction to translation machinery by miR-124 and-128 in neurons[J]. Mol Cell Biol， 2013,33(1):127-135.

[24] Stewart S A, Dykxhoorn D M, Palliser D, et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells[J]. RNA， 2003,9(4):493-501.

[25] 豐昀. KCTD10基因干擾RNA慢病毒載體的構(gòu)建[J]. 湖南師范大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2017,14(2)：9-11.