申燕軍 陳京龍 車娟娟 王 婧 曹邦偉*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤中心，北京 100050；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院腫瘤科，北京 100015)

原發(fā)性肝癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)在消化系惡性腫瘤中是發(fā)展比較快、臨床治療效果較差的惡性腫瘤之一；其病死率全球居第3位，在腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌，位于第2位[1-2]。在眾多的腫瘤增生與侵襲的分子通路中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，而其中Snail與Claudin-3則是EMT通路中的關(guān)鍵蛋白[3-4]。因此，探討Snail與Claudin-3蛋白與惡性腫瘤的發(fā)生與預(yù)后具有重要的臨床意義。目前尚未有涉及Snail和Claudin-3蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性研究。因此，針對(duì)上述兩種EMT通路中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行了肝細(xì)胞癌中的表達(dá)檢測(cè)，以期探索其表達(dá)狀態(tài)與肝細(xì)胞癌臨床特征的關(guān)聯(lián)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院與附屬北京友誼醫(yī)院2008年2月至2015年12月進(jìn)行根治性切除的HCC病例，其中臨床資料完整、石蠟組織完好的HCC病例82例，另取其對(duì)應(yīng)的60例離切緣大于5 cm癌旁正常組織作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：接受根治性肝癌切除術(shù)，術(shù)后病理診斷為原發(fā)性肝細(xì)胞癌；Child-Pugh分級(jí)為A-B級(jí)、且無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與肝性腦??；術(shù)前均未行相關(guān)抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝功能Child-Pugh C級(jí)、HCC合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、非原發(fā)的肝轉(zhuǎn)移性癌。收集入組患者臨床資料，包括一般狀況、腫瘤大小、位置、肝功儲(chǔ)備，并進(jìn)行規(guī)律隨訪，登記患者的疾病進(jìn)展時(shí)間、生存時(shí)間。

1.2 材料與方法

兔抗人Snail多克隆抗體(ab117866)，兔抗人Claudin-3多克隆抗體(ab15102)，免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所有標(biāo)本均經(jīng)過10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛固定、石蠟包埋，嚴(yán)格按技術(shù)規(guī)范手冊(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。分別用已知的結(jié)腸腺癌和胃腺癌組織作為Snail、Claudin-3蛋白表達(dá)的陽性對(duì)照；PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

Snail以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細(xì)胞；Claudin-3以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞。根據(jù)陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分比以及著色程度判斷：無明顯陽性細(xì)胞或著色細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%或著色較強(qiáng)者為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，獨(dú)立樣本比較采用χ2檢驗(yàn)，配對(duì)樣本比較采用McNemar檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman秩和相關(guān)系數(shù)表示。對(duì)生存數(shù)據(jù)進(jìn)行 Kaplan-Meier分析和 Log-rank 檢驗(yàn)，并繪制生存曲線。采用Cox回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行生存數(shù)據(jù)的多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者Snail與Claudin-3蛋白表達(dá)率

Snail陽性表達(dá)主要見于HCC細(xì)胞核或/和細(xì)胞質(zhì)中；Claudin-3陽性表達(dá)主要見于HCC細(xì)胞膜或/和細(xì)胞質(zhì)中。82例HCC組織，其中39例癌組織Claudin-3染色陽性(圖1A)，陽性率為 47.61%。60例癌旁組織，其中47例陽性(圖1B)，陽性率為78.31 %。兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。82例HCC組織，其中57例癌組織Snail染色陽性(圖1C)，陽性率為69.47%。60例癌旁組織，其中22例陽性(圖1D)，陽性率為36.58%。兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，詳見表1。

2.2 Snail和Claudin-3蛋白表達(dá)與HCC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

Snail和Claudin-3兩者的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.430，P<0.01)。但其表達(dá)均與微血管侵犯明顯相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=60.37,P=0.001;χ2=16.38,P=0.011)。同時(shí)Snail和Claudin-3表達(dá)與病理分期(pathology tumor lymph node metastasis, pTNM)較晚的分期有一定的相關(guān)性，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.90,P=0.015;χ2=4.91,P=0.027)。而年齡、性別、腫瘤大小、病理分級(jí)、肝硬化等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

表1 Snail與Claudin-3蛋白在HCC癌組織與癌旁組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of Snail and Claudin-3 protein in HCC or adjacent liver tissues n(%)

HCC：hepatocellular carcinoma.

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝癌組織Claudin-3與Snail的表達(dá)Fig.1 Expression of Claudin-3 and Snail in HCC by immunohistochemical(200×)

A: expression of Claudin-3 in HCC;B: expression of Claudin-3 in normal liver tissues;C: expression of Snail in HCC ;D: expression of Snail in normal liver tissues;HCC:hepatocellular carcinoma.

表2 Snail與Claudin-3蛋白的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression of Snail or Claudin-3 protein and thepathological characteristics of HCC

2.3 Snail和Claudin-3表達(dá)與HCC預(yù)后的關(guān)聯(lián)

分別比較Claudin-3與Snail表達(dá)陽性、陰性HCC患者的生存數(shù)據(jù)。Snail表達(dá)陽性、陰性的5年生存率分別為21.89%、37.11%；兩組生存率差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.001)。Claudin-3表達(dá)陽性、陰性的5年生存率分別為36.72%、21.70%。兩組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，詳見圖2。

2.4 HCC患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析結(jié)果

多因素分析顯示Snail、Claudin-3蛋白的表達(dá)是能夠影響肝癌術(shù)后生存期的獨(dú)立因素。相對(duì)危險(xiǎn)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示Snail陽性HR=3.12(95%CI: 2.57～3.78)；Claudin-3陽性HR=0.59(95%CI: 0.53～0.67)。表3中的結(jié)果顯示腫瘤大小、病理分級(jí)、TNM分期、微血管侵犯等也是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

EMT是指腫瘤細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的過程，具有去分化特征。上皮細(xì)胞極性喪失主要體現(xiàn)為蛋白標(biāo)記的丟失，如：E-cadherin、Claudin、Occludins、Mucl等；其中E-cadherin在上皮細(xì)胞間黏附起著重要的作用，Claudin能維持細(xì)胞的完整性[5]。因而E-cadherin、Claudin的表達(dá)減少或不表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力增強(qiáng)，故在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。Snail蛋白表達(dá)同樣可以調(diào)控EMT，它主要通過抑制E-cadherin、Claudin的表達(dá)來促進(jìn)EMT發(fā)生[8]。Claudin是組成緊密連接(tight junction, TJ)的骨架蛋白，有維持細(xì)胞的屏障功能。Claudin-3是其家族成員之一。已有研究[9-12]顯示，Claudin在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用各異，Claudin-3在某些惡性腫瘤中表達(dá)升高，如胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌等；而另一些癌癥中下調(diào)，如肺鱗癌及三陰乳腺癌[13]。

圖2 HCC患者中Snail與Claudin-3的表達(dá)與預(yù)后的生存分析Fig.2 Survival analysis of HCC patients with or not expressionA: Snail; B: Claudin-3；HCC:hepatocellular carcinoma.

Single factor analysisPHR(95%CI)Multifactor analysisPHR(95%CI)Age0.7700.99(10.99-1.01)Gender0.1641.09(0.97-1.22)Hepatocirrhosis0.9951.01(0.99-1.09)Stages of pTNM<0.0012.11(1.98-2.25)0.0011.74(1.59-1.91)Edmondson-Steiner0.0011.44(1.31-1.59)<0.0011.88(1.68-2.09)Tumor size0.0013.42(2.95-3.97)0.0031.62(1.31-2.01)Microvascular invasion0.0161.12(1.02-1.22)<0.0011.72(1.43-2.06)Expression of Snail0.0102.19(2.00-2.39)<0.0013.12(2.57-3.78)Expression of Claudin-30.0010.52(0.47-0.56)<0.0010.59(0.53-0.67) TNM: tumor lymph node metastasis;HCC:hepatocellular carcinoma.

本課題組研究顯示，在HCC中Claudin-3蛋白表達(dá)的陽性率低于癌旁組織，其表達(dá)在微血管侵犯、pTNM分期相關(guān)方面有相關(guān)性且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示Caudin-3低表達(dá)HCC腫瘤細(xì)胞的侵襲能力較強(qiáng)。在多因素分析中，Claudin-3是影響肝癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且Claudin-3低表達(dá)患者的5年生存率明顯較低，表明Claudin-3低表達(dá)的HCC患者的預(yù)后較差。同時(shí)本研究表明，Snail蛋白在HCC中陽性表達(dá)明顯高于癌旁組織，在pTNM分期、微血管侵犯相關(guān)方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)果提示在Snail高表達(dá)時(shí)，HCC腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲性。另外，在多因素分析中Snail蛋白也同樣是可影響患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且在Snail蛋白高表達(dá)時(shí)5年生存率明顯偏低。本研究中顯示Claudin-3與Snail蛋白的表達(dá)兩者呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步在臨床數(shù)據(jù)中印證了Snail與Claudin-3蛋白與HCC的發(fā)生、侵襲的關(guān)聯(lián)。因此進(jìn)行HCC患者Snail、Claudin-3蛋白的聯(lián)合檢測(cè)，在臨床實(shí)踐中對(duì)HCC患者病理學(xué)特征與預(yù)后的判斷具有重要的提示作用；對(duì)Snail高表達(dá)與Claudin-3低表達(dá)的HCC患者術(shù)后應(yīng)密切隨診。

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