趙建華，尹 躍，李浩霞，王亞軍，李彥龍，安 巍*

(1 寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所/國家枸杞工程技術(shù)研究中心，銀川 750002；2 寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所，銀川750002)

枸杞果實中富含有豐富糖類物質(zhì)，主要糖有果糖、葡萄和蔗糖[1]，其中，果糖和葡萄糖是成熟枸杞果實中積累的主要糖[2]。植物果實中游離的果糖在果糖激酶(fructokinase, FRK, EC 2.7.1.4)和己糖激酶(hexokinase, HK, EC 2.7.1.1)作用下被磷酸化后參與其他代謝，但前者對果糖親和力顯著高于后者[3]，這表明果糖激酶(FRK)是果糖磷酸化的主要催化酶。此外，果糖激酶(FRK)還可作為糖信號感受器調(diào)控植物生長發(fā)育。在FRK2-RNAi雜交山楊苗的木質(zhì)部纖維和細胞壁中，纖維素含量隨著FRK活性降低而減少[4]；轉(zhuǎn)FRK2反義抑制子的番茄中會導(dǎo)致果糖和蔗糖積累和維管束發(fā)育[5]；番茄FRK4僅在花粉萌發(fā)期及后期特異表達[6]。因此，對枸杞果糖激酶基因進行表達分析，有助闡明枸杞果實糖代謝機理，為改善枸杞果實品質(zhì)提供理論依據(jù)。

目前已分離鑒定出十多種植物FRK基因，如馬鈴薯[7]、甜菜[8]、番茄[9]、擬南芥[10]、水稻[11]、玉米[12]、甘蔗[13]、蜜柑[14]、枇杷[15]等。從蘋果中分離出4 個果糖激酶基因，其中，MdFK1和MdFK2在莖尖中的表達量明顯高于成熟葉片，且前者幼果中表達量低于成熟果實，但幼果中MdFK2 ～MdFK4表達量卻高于成熟果實[16]。在甘蔗中鑒定出7個果糖激酶基因SsFRK1～SsFRK7，發(fā)現(xiàn)SsFRK1是果糖磷酸化的主要激酶，SsFRK2和SsFRK7是果糖激酶家族中表達量較低成員，干旱脅迫誘導(dǎo)SsFRK3和SsFRK5顯著提高，SsFRK4和SsFRK6呈現(xiàn)出相似表達模式，但前者在成熟組織比未成熟組織表達量高[17]。近年，隨著模式植物研究和基因組研究的快速發(fā)展，植物FRK基因研究進展加快，在擬南芥、番茄和水稻中FRK基因功能已有較為深入的研究[18-19]。

目前，有關(guān)枸杞果實中FRK基因的克隆表達研究尚未見報道。本研究以‘寧杞1號’枸杞果實為材料，基于枸杞果實轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，克隆出枸杞果實家族中LbFRK7的cDNA全長，并分析了枸杞果實發(fā)育期LbFRK7的表達特征及果糖含量變化規(guī)律，為進一步研究枸杞FRK基因的功能及枸杞果糖代謝機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試枸杞品種為‘寧杞1號’(12～15年生)，均采自種質(zhì)資源庫，于‘寧杞1號’幼果期(開花后約9 d)、青果期(開花后約15 d)、色變期(開花后約22 d)、初熟期(開花后約29 d)和成熟期(開花后約36 d)分別采樣，選取果粒大小均勻、果色一致的無病蟲害的果實，用液氮迅速凍結(jié)后，運送回實驗室后立即放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ囼炘O(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)隨機選取5 g樣品進行糖含量測定。

1.2 方 法

1.2.1LbFRK7基因cDNA全長的克隆采用Trizol 試劑盒(天根)提取枸杞果實的總RNA，用RT-PCR試劑盒(ThermoFisher)對提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得單鏈cDNA?；谵D(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得unigene編號為TR28373|c0_g1的EST序列(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計全長引物FRK-F和FRK-R(表1)。反應(yīng)體系為：2× PCR Buffer 25 μL，dNTP (2 mmol/L) 10 μL，F(xiàn)RK-F (10 μmol/L) 2 μL，F(xiàn)RK-R (10 μmol/L) 2 μL，單鏈cDNA 1 μL，KOD FX Neo(Toyobo Life Science Cat)1 μL，Millipore H2O補足50 μL。反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)為98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；68 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體(TaKaRa)上進行測序。

表1 引物序列Table 1 Primers used in experiment

1.2.2實時熒光定量表達分析根據(jù)LbFRK7基因序列設(shè)計熒光定量引物FRK-qRTF和FRK-qRTR(表1)。18S基因作為內(nèi)參基因。在BIO-RAD CFX ConnectTM熒光定量 PCR 儀中進行擴增，反應(yīng)體系為：Power SYBR?Green PCR Master Mix (Applied Biosystems Cat)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，cDNA模板5 μL，Millipore H2O補足25 μL。反應(yīng)條件為：95.0 ℃預(yù)變性3 min；循環(huán)為95.0 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，75 ℃讀板5 s，共40個循環(huán)；溶解曲線從65 ℃上升到95 ℃，每次讀板上升0.5 ℃。LbFRK7在不同發(fā)育期果實中的相對表達量采用比較閾值法測定。通過計算2-ΔΔCT值來確定該基因的相對表達量。

1.2.3生物信息學(xué)分析用DNAman軟件推導(dǎo)出LbFRK7相應(yīng)氨基酸序列。利用ProtParam(http: //web.expasy.org/ protparam/)完成蛋白基本性質(zhì)分析。采用PSORT Prediction(http: //psort1.hgc.jp/form.html)完成亞細胞定位分析。使用NCBI Conserved Domains(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure /cdd/wrpsb.cgi)對序列的結(jié)構(gòu)域和功能進行分析。在NCBI網(wǎng)站運行的Blastp程序數(shù)據(jù)庫中對LbFRK7氨基酸序列進行相似性搜索。利用MEGA7軟件中提供的比對功能進行多序列比對并基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4枸杞果實中果糖和葡萄糖含量測定果糖和蔗糖含量提取和測定參考趙建華等的HPLC方法[20]。每個樣品重復(fù)3次，采用Microsoft Excel 2003和DPS8.05統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞LbFRK7基因克隆分析

基于枸杞轉(zhuǎn)錄組差異表達數(shù)據(jù)比對分析，發(fā)現(xiàn)TR28373|c0_g1的EST基因在枸杞果實發(fā)育過程中FPKM值呈現(xiàn)出顯著差異。以TR28373|c0_g1的EST序列設(shè)計特異性引物，并從枸杞果實的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中獲得枸杞FRK基因片段(圖1)，測序結(jié)果為1 060 bp(圖2)，含有1個1 044 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼有348個氨基酸，其理論等電點和分子量分別為5.05和37.44 kD，該基因的氨基酸序列分子式為C1659H2646N448O512S12，包含46個堿性氨基酸(Asp+Glu)和40個酸性氨基酸(Arg+Lys+His)。脂肪酸系數(shù)為95.33，不穩(wěn)定系數(shù)為33.03，是一個較穩(wěn)定的蛋白。

2.2 枸杞LbFRK7基因所編碼氨基酸序列及進化樹分析

將枸杞LbFRK7基因所編碼氨基酸序列進行Blastp分析，該序列與其他植物FRK7基因編碼的氨基酸序列有較高一致性，該基因命名為LbFRK7，NCBI注冊號為KX584482。

進一步利用NCBI Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure /cdd/ wrpsb. cgi)對LbFRK7序列的結(jié)構(gòu)域和功能進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因Ser17-Ala347位氨基酸序列與FRP結(jié)構(gòu)域(PLN02323)有較高相似性，其E-value為0e+00。該蛋白具有pfkB碳水化合物激酶家族(phosphofructokinase B type family of carbohydratekinase)的高度保守的特性，包括了3個底物結(jié)合位點，4個ATP結(jié)合位點和3個pfkB家族特異性區(qū)域(圖2)。對其進行亞細胞定位結(jié)果表明，該酶有可能是一種葉綠體蛋白。

圖1 枸杞 LbFRK7的 PCR擴增電泳檢測結(jié)果Fig.1 PCR amplification and agarose gel electrophoresis of LbFRK7

利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blastp比對發(fā)現(xiàn)，LbFRK7氨基酸序列與煙草和辣椒的FRP7基因編碼的氨基酸序列相似性較高，序列相似性達到90%。利用MEGA軟件構(gòu)建16份雙子葉植物的FRP7基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，16份雙子葉植物可分為3類，Ⅰ類為十字花科植物；Ⅱ類為茄科植物；Ⅲ類為豆科植物。枸杞的LbFRK7氨基酸序列與茄科植物同屬一個分支，這表明FRP7基因在物種進化過程中較為保守，物種間存在相對獨立分化過程。這也與陳毅鴻等研究[18]FRP基因家族演化是很保守的結(jié)論相一致。

圖2 LbFRK7測序結(jié)果及預(yù)測氨基酸序列分析Fig.2 Sequencing results and amino acid sequence analysis of LbFRK7

2.3 枸杞果實發(fā)育過程中LbFRK7基因的表達特征

qRT-PCR 分析結(jié)果(圖4，Ⅰ)顯示，LbFRK7在枸杞果實不同發(fā)育期的表達變化特征為，在開花后9 d時檢測到果實中LbFRK7表達量最低，隨后顯著升高，并在開花后15 d時果實中LbFRK7表達量達到最高，15 d后(到果實成熟期)LbFRK7的表達量逐漸下降。這表明LbFRK7基因在枸杞果實發(fā)育的前期(開花后0～15 d)發(fā)揮著重要作用。

2.4 枸杞不同組織器官中LbFRK7基因的表達特征

枸杞植株根、莖、葉、果實等組織器官中的LbFRK7表達量變化結(jié)果(圖4，Ⅱ)表明，LbFRK7基因在枸杞整個植株中均有表達，其中，果實中表達量最高，根中表達量最低，且果實中的表達量顯著高于根、莖、葉等組織?？梢?，LbFRK7在枸杞果實中較為活躍，且存在著器官間的特異性。

2.5 枸杞果實發(fā)育過程中果糖和蔗糖含量的動態(tài)變化特征

隨著枸杞果實的發(fā)育進程，枸杞果實中果糖含量逐漸顯著升高(圖5，Ⅰ)，在果實成熟后到達最高；而蔗糖含量隨著果實發(fā)育不斷降低，其中，在開花后9～15 d顯著降低，隨后緩慢降低，并在果實成熟時(開花后36 d)降到最低。從圖4、圖5可以看出，在果實發(fā)育前期(開花后0～15 d)，LbFRK7基因的表達量與果糖含量均呈現(xiàn)出相同趨勢，但在果實發(fā)育中期和后期(開花后15～36 d)，LbFRK7表達量與果糖含量表現(xiàn)出相反變化趨勢。相關(guān)分析結(jié)果表明，在枸杞果實發(fā)育過程中，LbFRK7基因表達量與果糖和蔗糖含量的相關(guān)系數(shù)分別為-0.326和-0.339，但均未達到顯著水平。可見，LbFRK7在枸杞果實成熟過程中對果糖與蔗糖的相互轉(zhuǎn)化具有一定的作用。

3 討 論

隨著模式植物基因組研究進展加快，植物FRK基因功能也有較深入的研究，該基因的分子特征認識較為明確[18-19]。通過凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，番茄、馬鈴薯和甜菜等植物的FRK蛋白質(zhì)量大約在35～37 kD[8,21-22]，這些植物FRK編碼的蛋白具有明顯pfkB碳水化合激酶家族的特征[23]。本研究首次從枸杞果實中分離出LbFRK7基因，編碼347個氨基酸，其理論分子量為37.44 kD，該蛋白的分子質(zhì)量大小與番茄、馬鈴薯基本一致，但在馬鈴薯塊莖中還發(fā)現(xiàn)FRK蛋白質(zhì)量存在70或119 kD[24-25]，這是由于植物中FRK蛋白以二聚體形式存在，其功能部位是由分子量為30～40 kD的亞基組成的二聚體[26]，而枸杞FRK蛋白是否存在二聚體形式，有待于后續(xù)研究。進一步分析LbFRK7氨基酸序列結(jié)構(gòu)，該蛋白具有pfkB碳水化合激酶家族的顯著特征，具有高度保守的ATP結(jié)合位點，這表明LbFRK7進化也是很保守的。

圖3 枸杞與其他植物FRK7蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of FRK7 proteins in L. bararum and other plants

不同大小寫字母分別表示不同發(fā)育期或器官間在0.01和0.05水平上有顯著性差異；下同The different normal and capital letters indicate significant difference among five fruit development periods or organs at 0.05 and 0.01 levels, respectively; The same as below

圖5 枸杞果實發(fā)育期果實中果糖和蔗糖含量變化Fig.5 Changes of fructose and sucrose contents in L. bararum fruits during fruit development

本研究發(fā)現(xiàn)，枸杞LbFRK7氨基酸與其他15份雙子葉植物劃分為3類，且LbFRK7氨基酸與茄科的煙草、辣椒和番茄高度同源，被聚到一類，十字花科和豆科植物的FRK被聚為另外2類。這表明同科植物FRK基因同源性較高，基因結(jié)構(gòu)功能也較為相近，從而可以推測該基因存在相對獨立的進化過程，這與陳毅鴻等[18]發(fā)現(xiàn)植物FRK基因在單雙子葉植物的演化進程較為獨立基本一致。

植物中果糖激酶(FRK)是果糖磷酸化關(guān)鍵催化酶，在果糖代謝中發(fā)揮著重要作用[3,27]，玉米中克隆到的2個果糖激酶基因ZmFR1和ZmFR2重組蛋白具有明顯的特異性，其活性均能被果糖抑制，但前者對果糖較不敏感[12]；通過對番茄FRK2的反義抑制，莖部的果糖和蔗糖含量升高[5]。本研究發(fā)現(xiàn)LbFRK7在枸杞果實中表達量最高，且隨著果實發(fā)育表達量呈現(xiàn)出先升后降變化，而果實中果糖含量表現(xiàn)為逐漸升高趨勢，蔗糖含量卻表現(xiàn)為逐漸降低趨勢，LbFRK7表達量與果糖和蔗糖含量均未達到顯著相關(guān)水平。本研究表明LbFRK7在枸杞果實發(fā)育初期大量表達，在果實發(fā)育中后期表達量逐漸降低，該時期與果糖含量呈現(xiàn)出相反變化趨勢。這與陳馨等[18]對楊梅果糖激酶研究完全一致。這可能是果實中果糖被FRK磷酸化后降低了果糖的濃度，從而促進了轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶對蔗糖分解[28]，但當(dāng)果糖濃度超過2 mmol/L時FRK活性會受抑制[29]?？梢?，在枸杞果實發(fā)育的前期，由于果糖大都被FRK磷酸化，使果糖含量維持著較低水平，但隨著果實快速膨大，輸入的大量光合產(chǎn)物(蔗糖)分解成果糖與葡萄糖，果糖大量積累，從而使果實中LbFRK7表達量降低。

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