陳宏麗，柴菲，尹剛，楊敬，任曉俊(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西汾陽0300；山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院)

舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)是最常見的口腔癌，其特點(diǎn)為惡性程度高、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、早期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。TNM分期可對(duì)治療前腫瘤范圍及轉(zhuǎn)移進(jìn)行評(píng)估，但對(duì)TSCC的評(píng)估有局限性。因此亟需尋找新的生物學(xué)及臨床標(biāo)志物對(duì)TSCC進(jìn)行評(píng)估[2]。轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2被認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心[3]，Oct4、Sox2與腫瘤干細(xì)胞(CSC)密切相關(guān)，表達(dá)Oct4、Sox2的腫瘤細(xì)胞有類似CSC的表現(xiàn)[4]。Oct4、Sox2在人類惡性腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，而在異種移植腫瘤中敲除Oct4與Sox2基因可抑制腫瘤的形成[5]。研究表明，Oct4在生殖細(xì)胞瘤、乳腺癌、宮頸癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等組織中過表達(dá)[6]；且Oct4與CSC的活性和功能密切相關(guān)[7]。Sox2在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、腦腫瘤等腫瘤組織中高表達(dá)[8]；其與腫瘤細(xì)胞的增殖活性、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[9]。目前TSCC發(fā)生的機(jī)制尚不清楚。本研究檢測(cè)Oct4、Sox2在TSCC組織中的表達(dá)，旨在為TSCC患者的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年12月～2012年1月山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院頜面外科手術(shù)切除的TSCC組織標(biāo)本83例?；颊吣?0例、女23例，年齡29～82(48.42±3.29)歲；WHO分類系統(tǒng)組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)38例、Ⅱ級(jí)32例、Ⅲ級(jí)13例；采用2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟指南進(jìn)行TNM分期，Ⅰ期30例、Ⅱ期30例、Ⅲ期15例、Ⅳ期8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例。患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①其病理組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，保存完整；且臨床資料、病理資料完整。②術(shù)前未接受放化療，以手術(shù)治療為初次治療。③原發(fā)于舌部，臨床與病理檢查均確診為TSCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。另選15例舌部非腫瘤手術(shù)患者舌正常黏膜組織作為對(duì)照。患者男12例、女3例，年齡25～78(46.58±2.96)歲。兩者性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者均簽訂知情同意書。

1.2 組織中Oct4、Sox2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP法。石蠟標(biāo)本常規(guī)連續(xù)切片(厚度2 μm)，脫蠟水化，用3% H2O2封閉10 min，PBS緩沖液浸泡，放入含EDTA的沸水中加熱行抗原修復(fù)，冷卻至室溫，滴加一抗(Oct4的一抗?jié)舛葹?∶100、Sox2的一抗?jié)舛葹?∶200，各1～2滴)，4 ℃冰箱過夜；PBS清洗后滴加羊抗鼠IgG聚合物二抗，DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇缸脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以已知陽性切片作為陽性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的主治醫(yī)師行獨(dú)立雙盲法閱片。結(jié)果判定：Oct4定位于細(xì)胞核，Sox2定位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色至深棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)著色程度、陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。著色為棕褐色計(jì)3分，棕黃色計(jì)2分，淡黃色計(jì)1分，基本不著色計(jì)0分；陽性細(xì)胞百分比>75%計(jì)4分，50%<陽性細(xì)胞百分比≤75%計(jì)3分，25%<陽性細(xì)胞百分比≤50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞百分比≤25%計(jì)1分，陽性細(xì)胞百分比為0計(jì)0分。將以上兩項(xiàng)得分相加，計(jì)算總分(0～7分)，0～1分為表達(dá)陰性，2～7分為表達(dá)陽性。鼠抗人Oct4單克隆抗體及鼠抗人Sox2單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology Inc；快捷型酶標(biāo)羊抗鼠IgG聚合物、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)患者隨訪5年，記錄生存人數(shù)。生存影響因素采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸進(jìn)行單因素、多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSCC組織和舌正常黏膜組織中Oct4、Sox2蛋白表達(dá)比較 TSCC組織和舌正常黏膜組織中Oct4蛋白陽性表達(dá)率分別為87.95%(73/83)、13.33%(2/15)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TSCC組織和舌正常黏膜組織中Sox2蛋白陽性表達(dá)分別為93.98%(78/83)、26.67%(4/15)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Oct4、Sox2蛋白表達(dá)與TSCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Oct4、Sox2蛋白陽性表達(dá)均與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤臨床分期無關(guān)(P均>0.05)，與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

2.3 Oct4、Sox2蛋白表達(dá)與TSCC患者生存率的關(guān)系 隨訪5年，83例患者生存48例，生存率為57.83%(48/83)。其中73例Oct4蛋白陽性表達(dá)的患者存活40例，5年生存率為54.79%(40/73)；10例Oct4蛋白陰性表達(dá)的患者存活8例，5年生存率為80.00%(8/10)；二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。78例Sox2蛋白陽性表達(dá)的患者存活44例，5年生存率為55.13%(44/78)；5例Sox2蛋白陰性表達(dá)的患者存活4例，5年生存率為80.00%(4/5)；二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。68例Oct4與Sox2蛋白同時(shí)陽性表達(dá)的患者存活21例，5年生存率為30.88%(21/68)；4例Oct4和Sox2蛋白同時(shí)陰性表達(dá)的患者存活3例，5年生存率為75.00%(3/4)；二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。25例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者存活5例，5年生存率為2.00%(5/25)；58例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者存活43例，5年生存率為74.14%(43/58)；二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單因素分析：以83例患者為樣本，以患者的生存狀態(tài)為應(yīng)變量，賦值：死亡(1)、生存(0)、生存期(t)，以表1所列各臨床病理參數(shù)為自變量，逐一建立COX比例回歸模型。結(jié)果顯示，年齡、性別、吸煙、飲酒、腫瘤組織學(xué)分級(jí)及臨床分期與患者總生存率無關(guān)(P均>0.05)；Oct4、Sox2蛋白表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與患者總生存率有關(guān)(P均<0.05)。見表2。多因素分析：建立多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，回歸過程采用后退法，設(shè)定α退出=0.05，進(jìn)行自變量的選擇和剔除。結(jié)果，Sox2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移兩個(gè)因素均被保留入回歸方程(P均<0.05)，提示二者為TSCC患者5年生存率的影響因素。見表3。

表1 Oct4、Sox2蛋白陽性表達(dá)與TSCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

表2 TSCC患者5年生存率影響因素單因素分析

表3 TSCC患者5年生存率影響因素多因素分析

3 討論

TSCC是最常見的口腔癌類型，近幾年發(fā)病率居高不下。目前經(jīng)手術(shù)及放化療等治療后患者生存率仍無明顯提高，主要原因在于TSCC浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)移較快、發(fā)現(xiàn)較晚[10]。研究表明，TSCC的5年生存率約為30%，3年生存率為41.12%，而單用TNM分期無法對(duì)臨床及生物學(xué)特點(diǎn)頻繁變異的TSCC進(jìn)行評(píng)估。Tatetsu等[11]研究證實(shí)，胚胎干細(xì)胞(ESC)相關(guān)的蛋白在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)；特別在維持ESC多能性和自我更新方面有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Sox2。Zhang等[12，13]研究表明二者在體內(nèi)外穩(wěn)定表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤的耐藥能力，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。

Oct4主要作用是維持ESCs的多能性狀態(tài)，在正常成熟細(xì)胞中不表達(dá)，近來發(fā)現(xiàn)在口腔癌干細(xì)胞中表達(dá)。本研究中Oct4在舌正常黏膜基底層同樣表達(dá)。與舌正常黏膜組織相比，Oct4蛋白在TSCC中陽性表達(dá)率高；且Oct4蛋白陽性表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤臨床分期無關(guān)，與腫瘤組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。Oct4蛋白陽性表達(dá)率越高，腫瘤分化程度越低。表示Oct4在TSCC組織中可能促進(jìn)低分化表型的TSCC細(xì)胞喪失分化能力。Oct4蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Oct4蛋白陽性表達(dá)率越高，TSCC患者越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示Oct4可能與腫瘤的侵襲和浸潤(rùn)相關(guān)，與Lopes等[14]報(bào)道一致。

Sox2屬于轉(zhuǎn)錄因子SOX基因家族，參與性別、神經(jīng)發(fā)育、多種血細(xì)胞生存等發(fā)育過程的調(diào)控。項(xiàng)保利等[15]研究表明，Sox可調(diào)控干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在腫瘤的發(fā)展中，Sox調(diào)控的CSC自我更新和增殖，形成各種類型癌細(xì)胞，被認(rèn)為與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果示，Sox2蛋白在TSCC中陽性表達(dá)率高，且與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤臨床分期無關(guān)，與腫瘤組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。即Sox2蛋白陽性表達(dá)率越高，腫瘤分化程度越低。Züllig等[16]研究同樣證實(shí)，Sox2具有使TSCC細(xì)胞保持低分化的能力。本研究顯示，Sox2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Sox2蛋白陽性表達(dá)率越高，TSCC患者越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示Sox2可能與腫瘤的侵襲和浸潤(rùn)相關(guān)，這與Qiao等[17]研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果提示，與Oct4、Sox2蛋白陰性表達(dá)患者相比，Oct4、Sox2蛋白陽性表達(dá)的患者總生存率明顯降低。且多因素分析發(fā)現(xiàn)：Sox2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可作為TSCC患者總生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。姜新娣等[18]研究結(jié)果也表明，Oct4高表達(dá)的患者生存率低。Yoshihama等[19]研究表明，Oct4和Sox2共表達(dá)譜為乳腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物。Park等[20]研究也證明其與肝癌、口腔癌的預(yù)后密切相關(guān)。因此Oct4和Sox2共表達(dá)譜在維持CSC的生物學(xué)行為方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果示：Oct4和Sox2蛋白同時(shí)陽性表達(dá)的患者總生存率低。提示聯(lián)合檢測(cè)Oct4、Sox2蛋白表達(dá)比單獨(dú)檢測(cè)可更精準(zhǔn)地反映TSCC預(yù)后。

綜上所述，Oct4、Sox2蛋白陽性表達(dá)率越高，TSCC組織學(xué)分級(jí)越低，越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且Oct4、Sox2蛋白同時(shí)陽性表達(dá)者總生存率最低。Sox2及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可作為TSCC患者總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，為臨床治療及檢測(cè)提供了較為可靠的方案。但是本文缺陷在于樣本量較小，下一步仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

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