王輝，韓琛，董新茜，盛仲楠，李同民，李真真，王恒孝1，(1濟(jì)南大學(xué)·山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南006；東昌府區(qū)婦幼保健院；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；聊城市人民醫(yī)院；聊城市中醫(yī)院)

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科腫瘤之一，起源于子宮內(nèi)膜上皮，發(fā)病人群主要集中在圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后的女性[1，2]。近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率不斷上升，對女性的生命健康構(gòu)成巨大的威脅。隨著臨床治療水平的不斷提高，早期(Ⅰ、Ⅱ期)子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后有明顯改善，在接受有效治療后患者5年生存率可達(dá)90%；但晚期(Ⅲ、Ⅳ期)子宮內(nèi)膜癌患者的治療效果不容樂觀，患者5年生存率僅為15%[3]。子宮內(nèi)膜癌患者在早期通常無明顯的特異性癥狀，部分患者直至晚期才發(fā)現(xiàn)病情，因此臨床治療依然較為棘手。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的速度密切相關(guān)。正常細(xì)胞增殖、凋亡受機(jī)體控制，而腫瘤細(xì)胞則處于失控狀態(tài)，其中多種基因、信號蛋白參與了這個過程[4，5]。增生細(xì)胞核抗原(Ki-67)是一種與細(xì)胞核增殖密切相關(guān)的抗原，其表達(dá)水平可側(cè)面反映細(xì)胞的增殖情況[6]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)是一種細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，是細(xì)胞程序性死亡過程中的拮抗蛋白，能調(diào)控細(xì)胞信號途徑，延緩細(xì)胞凋亡[7]。位于人類17號染色體短臂上p53基因是細(xì)胞內(nèi)一種重要的腫瘤抑制基因，能讓受損細(xì)胞停滯于G1或G2期進(jìn)行修復(fù)，同時還可誘導(dǎo)變異細(xì)胞凋亡[8]。本研究探討Ki-67、Bcl-2及p53蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)變化及臨床意義，以期為臨床診斷子宮內(nèi)膜癌及預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2017年6月聊城市東昌府區(qū)婦幼保健院與聊城市人民醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜癌患者60例，收集術(shù)中切除的癌組織作為觀察組?；颊吣挲g35～70(51.34±6.75)歲；臨床分期為Ⅰ期10例、Ⅱ期27例、Ⅲ期21例、Ⅳ期2例；分化程度為低分化25例、中分化18例、高分化17例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或脈管內(nèi)查見瘤栓者25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或脈管內(nèi)未查見瘤栓者35例；肌層浸潤程度≥1/2 35例，<1/2 25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理學(xué)檢查確診[9]；預(yù)估生存期>3個月；未合并其他類型的腫瘤；未接受放化療或內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在心、肝、腎等重大臟器損傷；臨床資料缺失；妊娠期或哺乳期。同期收集20例子宮肌瘤、20例單純性增生、10例復(fù)雜性增生患者的子宮正常內(nèi)膜組織作為對照組?；颊吣挲g31～65(50.14±7.15)歲。兩組年齡具有可比性?；颊呒捌浼覍賹Ρ狙芯恐橥狻１狙芯揩@得聊城市東昌府區(qū)婦幼保健院和聊城市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 組織中Ki-67、Bcl-2及p53蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化染色技術(shù)。病理組織在離體后即刻進(jìn)行處理，采用10%的甲醛固定，行常規(guī)石蠟包埋切片。取切片，熱處理融化石蠟(60 ℃)，依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中各6 min，再依次浸入100%、95%、80%、70%的乙醇中各5 min，自來水沖洗10 min。滴加適量的3% H2O2，封閉20 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3次，各3 min。浸入枸櫞酸鈉緩沖液中，采用高壓鍋進(jìn)行抗原熱修復(fù)。自然冷卻后浸入10%的山羊血清封閉15 min，甩去切片表面的封閉液(勿洗)，滴加稀釋好的一抗(Ki-67、p53多克隆抗體均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Ki-67稀釋濃度1∶200，p53稀釋濃度1∶100；Bcl-2購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，即用型)，37 ℃孵育2 h，PBS緩沖液沖洗2次，各5 min。滴加二抗(羊抗兔IgG，購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗2次，各5 min。滴加HRP標(biāo)記的親和素，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗2次，各5 min。DAB顯色，自來水緩慢沖洗10 min，蘇木素溶液復(fù)染3 min，PBS返藍(lán)5 min。依次浸入80%、95%、100%、100%的乙醇中，各3 min，后浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中，各5 min，中性樹膠封片，晾干。結(jié)果判定：采用顯微鏡在高倍鏡(×400)下觀察，Ki-67及p53于細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色為陽性表達(dá)，Bcl-2于細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色為陽性表達(dá)。隨機(jī)選取5個視野，統(tǒng)計(jì)每個視野的陽性細(xì)胞百分比，計(jì)算平均值。對陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。若無陽性細(xì)胞計(jì)0分，陽性細(xì)胞百分比<10%計(jì)1分，若10%≤陽性細(xì)胞百分比≤50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞百分比>50%計(jì)3分；若無著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。兩項(xiàng)得分總和<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白表達(dá)比較 觀察組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性表達(dá)率分別為63.33%(38/60)、80.00%(48/60)、56.67%(34/60)；對照組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性表達(dá)率分別為30%(15/50)、52%(26/50)、0。觀察組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性表達(dá)率均高于對照組(P均<0.05)。

2.2 Ki-67、Bcl-2及p53蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)與患者年齡無關(guān)(P>0.05)，與臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)(P均<0.05)；Bcl-2蛋白陽性表達(dá)與年齡、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)，與臨床分期、分化程度有關(guān)(P均<0.05)；p53蛋白陽性表達(dá)與年齡、肌層浸潤深度無關(guān)(P均>0.05)，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

表1 Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是激素依懶性腫瘤，好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性，其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。研究表明其與激素刺激、遺傳因素、糖尿病、高血壓、肥胖等因素有關(guān)[9，10]。子宮內(nèi)膜癌在歐美的發(fā)病率高居?jì)D科惡性腫瘤的首位，每年的新發(fā)病例約占新發(fā)婦科惡性腫瘤病例的一半[11]。目前對于晚期子宮內(nèi)膜癌患者仍無高效的治療方案，治療效果和患者的預(yù)后仍然不理想[12,13]。無限增殖是腫瘤細(xì)胞的主要特點(diǎn)之一，正常細(xì)胞生長到相互接觸后，其運(yùn)動和分裂活動均會逐漸停止，而腫瘤細(xì)胞則不受細(xì)胞接觸的影響，在體外培養(yǎng)時腫瘤細(xì)胞可堆積成立體細(xì)胞群。無限增殖也是腫瘤細(xì)胞易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的重要原因[14]。細(xì)胞凋亡是指在凋亡刺激信號的作用下細(xì)胞發(fā)生程序性變性和死亡的過程。細(xì)胞凋亡對維持組織器官的正常功能和形態(tài)具有重要的作用，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前臨床上的放化療就是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來達(dá)到治療的目的[15]。細(xì)胞增殖、凋亡之間的動態(tài)平衡保證了機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，也是組織穩(wěn)定的必要條件，若這種平衡被打破則可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而Ki-67、Bcl-2及p53等與腫瘤細(xì)胞的增殖或凋亡密切相關(guān)[16，17]。

本研究中觀察組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性表達(dá)率高于對照組，說明在子宮內(nèi)膜癌組織中Ki-67、Bcl-2及p53均呈高表達(dá)，提示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與三者的表達(dá)水平有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中的Ki-67蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)，Bcl-2蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期、分化程度有關(guān)，p53蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)。說明子宮內(nèi)膜癌組織中的Ki-67、Bcl-2及p53的表達(dá)可影響患者的臨床轉(zhuǎn)歸。臨床可通過檢測患者子宮內(nèi)膜癌組織中Ki-67、Bcl-2及p53表達(dá)來評估患者的病情。丁堪鑠等[2]的研究顯示，Ki-67、p53的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與本研究結(jié)果類似。Ki-67是增殖細(xì)胞中表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白，在有絲分裂時可保護(hù)DNA結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞的分裂周期中，Ki-67在G0期不表達(dá)，在G1期、S期、G2期、M期均有不同程度的表達(dá)，M期后期Ki-67會很快消失，且Ki-67的半衰期很短，通常不會超過1 h，因此Ki-67可反映出細(xì)胞增殖的情況[18]。Ki-67表達(dá)水平越高則提示細(xì)胞增殖速率越快，因此其在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，且與臨床分期、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其主要通過調(diào)控細(xì)胞凋亡來調(diào)控腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中，Bcl-2可將凋亡蛋白活化因子1(Apaf-1)等定位至線粒體膜上，阻礙Apaf-1發(fā)揮凋亡作用。并且Bcl-2還可通過抑制谷胱甘肽外泄來降低胞內(nèi)的氧化還原電位，多種途徑協(xié)同作用抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[19]。p53是一種重要的抑癌基因，可以抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而在多種惡性腫瘤中50%以上的p53基因會發(fā)生不同位點(diǎn)、不同形式的突變，其中最為常見的是5-8外顯子點(diǎn)的突變，突變后的p53基因?qū)适б职┳饔?，轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[20，21]。

綜上所述，在子宮內(nèi)膜癌組織中Ki-67、Bcl-2及p53蛋白均呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者部分臨床病理參數(shù)有關(guān)。臨床可通過檢查患者子宮內(nèi)膜癌組織中Ki-67、Bcl-2及p53蛋白表達(dá)來評估患者的病情。

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