徐斌武，李 晨

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330000)

骨肉瘤屬于骨惡性腫瘤中發(fā)病率最高、惡性程度較高的腫瘤，成為兒童、青少年腫瘤相關(guān)致死病因的第二位，嚴(yán)重影響我國(guó)年輕人健康與生命[1]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示[2]：肺部是骨肉瘤最為常見的轉(zhuǎn)移器官(占90.0%)，且患者5年生存率僅有20.0%。細(xì)胞的增殖與凋亡屬于是一種動(dòng)態(tài)平衡，該平衡的打破是腫瘤產(chǎn)生的重要原因，也是腫瘤發(fā)生的重要病因。因此，臨床上如何采取有效的措施抑制腫瘤的增殖，促進(jìn)腫瘤的凋亡成為骨肉瘤治療的熱點(diǎn)[3]。腫瘤干細(xì)胞(Tumor stem cell)是指腫瘤內(nèi)存在的一小部分細(xì)胞亞群，在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲及腫瘤血管化等方面起核心作用，能自我更新、分化和增殖。而傳統(tǒng)手術(shù)、放療、化療之所以無(wú)法實(shí)現(xiàn)腫瘤的治愈，多是由于上述方法僅殺死了非腫瘤干細(xì)胞，縮小腫瘤體積，而忽略了腫瘤的“種子”-腫瘤干細(xì)胞[4]。研究表明[5]：線粒體融合基因2在骨肉瘤中能抑制干細(xì)胞增殖，有助于降低腫瘤轉(zhuǎn)移率，但是不同學(xué)者試驗(yàn)結(jié)果存在爭(zhēng)議。因此，本課題以MG63骨肉瘤細(xì)胞系、8周齡NOD/SCID小鼠作為研究對(duì)象，探討線粒體融合基因2抑制骨肉瘤增殖及對(duì)其轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取6組8周齡NOD/SCID小鼠各20只作為研究對(duì)象，建立骨肉瘤成瘤和肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，根據(jù)Mfn2轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細(xì)胞隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63組、轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-瘤MG63組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤干細(xì)胞組和空白對(duì)照1組和空白對(duì)照2組。120只小鼠體質(zhì)量20～25 g，平均(21.45±4.75)g，所選動(dòng)物均由醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：scxk2008-0020。課題中對(duì)小鼠飼養(yǎng)、處理符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)下意見》相關(guān)規(guī)則，飼養(yǎng)時(shí)控制實(shí)驗(yàn)室恒溫(20±2)℃，恒濕50%～60%，實(shí)驗(yàn)均通過醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2主要儀器和試劑：本課題所需儀器和試劑主要由人骨肉瘤MG63細(xì)胞株、real time PCR儀、Ministar低溫超速離心機(jī)、Thermo全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、高速冷凍離心機(jī)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、MTT、Mfn2多克隆抗體、手術(shù)器械一套等。

1.3方法：①骨肉瘤MG63及其干細(xì)胞Mfn2表達(dá)：將MG63骨肉瘤細(xì)胞系體外培養(yǎng)，通過球體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(Sphere Culture Assay)分離出骨肉瘤干細(xì)胞。分離出骨肉瘤干細(xì)胞每14天傳代1次，第三代骨肉瘤干細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Mfn2基因在骨肉瘤干細(xì)胞中的表達(dá)情況。引物序列：Mfn2上游引物5′-AGGGACTTGCCTCTCTTCTC-3′，下游引物5′-TCCACCATCCATCCTTCTAC-3′，產(chǎn)物片段143 bp；GADPH 上游引物5′-GACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，下游引物5′-CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′，產(chǎn)物片段187 bp。引物合成后完成組織總RNA的提取并合成cDNA的合成，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后采用光度計(jì)在260 nm/280 nm下測(cè)得，根據(jù)A260/A280比值完成純度的測(cè)定(1.8～2.0)，測(cè)定完畢后利用濃度為2%瓊脂糖進(jìn)行電泳。②增殖實(shí)驗(yàn)：分別取Mfn2轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后的骨肉瘤干細(xì)胞，對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別在第1天、第3天、第5天、及第7天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況。③Mfn2對(duì)轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響：選取6組8周齡NOD/SCID小鼠各20只，20～25 g，雌雄各半。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為6組：轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63組、轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤干細(xì)胞和空白對(duì)照2組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)，選用第三代細(xì)胞。用無(wú)酶細(xì)胞分離溶液 (Sigma Biochemicals)懸浮形成單細(xì)胞懸浮溶液，細(xì)胞離心后PBS漂洗、重懸，再次離心。用PBS稀釋成106cell/ml備用。腹腔注射麻醉小鼠后消毒雙側(cè)后肢，于右后肢脛骨結(jié)節(jié)處穿刺至骨髓腔緩慢注射上述細(xì)胞懸浮液0.2 ml。穿刺處給予骨蠟封閉，充分止血，術(shù)后給予復(fù)方新諾明100 mg/kg預(yù)防感染，處理后每3天處死2只小鼠，研究骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié)果

2.1骨肉瘤MG63及其干細(xì)胞Mfn2表達(dá)：骨肉瘤MG63細(xì)胞中Mfn2表達(dá)水平高于干細(xì)胞(P<0.05)。見表1。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明：Mfn2在骨肉瘤MG63細(xì)胞中較干細(xì)胞中呈高表達(dá)，骨肉瘤干細(xì)胞表達(dá)Mfn2低于普通MG63細(xì)胞。

細(xì)胞類型Mfn2表達(dá)骨肉瘤MG63細(xì)胞0.64±0.16干細(xì)胞0.34±0.12t值16.993P值<0.05

2.2轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后骨肉瘤干細(xì)胞細(xì)胞增殖情況比較：轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后第1天、第3天細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染后第5天、第7天細(xì)胞數(shù)量，均少于轉(zhuǎn)染前(P<0.05)。見表2。

2.3Mfn2在不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染后骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移率比較：轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63組和轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干細(xì)胞組的小鼠骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移均較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤干細(xì)胞組和空白組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干細(xì)胞組的小鼠骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移較轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63組和空白對(duì)照骨肉瘤MG63組均較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤干細(xì)胞組和空白對(duì)照骨肉瘤干細(xì)胞組骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

時(shí)間點(diǎn)第1天第3天第5天第7天轉(zhuǎn)染前1.24±0.323.21±0.438.94±2.1613.26±3.09轉(zhuǎn)染后1.21±0.283.03±0.385.61±2.018.56±2.69t值1.2050.58315.38218.438P值>0.05>0.05<0.05<0.05

組別第28天第35天第42天轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63組38.53±5.1240.44±5.1044.51±5.68轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干細(xì)胞組34.55±5.9335.51±6.0739.39±6.31轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63組51.09±5.9464.42±6.1270.94±6.28轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤干細(xì)胞組67.04±5.1673.01±5.1289.04±5.69空白對(duì)照骨肉瘤MG63組52.53±6.7163.32±7.9570.42±9.32空白對(duì)照骨肉瘤干細(xì)胞組66.09±6.7574.04±7.9788.44±9.34

3 討論

骨肉瘤是臨床上常見的原發(fā)性惡性腫瘤，多發(fā)生于兒童與青少年人群，嚴(yán)重影響我國(guó)青少年健康。目前，臨床上對(duì)于骨肉瘤以手術(shù)治療、放化療為主，這些方法雖然能延緩病情發(fā)展，但是5年生存率較低，患者治療后復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率較高，難以達(dá)到預(yù)期的治療效果[6]。因此，臨床上如何采取有效的措施對(duì)延長(zhǎng)患者壽命、降低臨床死亡率具有重要的意義。近年來(lái)，線粒體融合基因2(Mfn2)在骨肉瘤中得到應(yīng)用，且效果理想。本研究中，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明：Mfn2在骨肉瘤MG63細(xì)胞中較干細(xì)胞中呈高表達(dá)，骨肉瘤干細(xì)胞表達(dá)Mfn2低于普通MG63細(xì)胞。由此看出Mfn2在干細(xì)胞中呈高表達(dá)，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化。線粒體融合蛋白2基因是由我國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，采用mRNA差異顯示技術(shù)測(cè)得，限于當(dāng)時(shí)水平并未進(jìn)行深入研究。本研究骨肉瘤干細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Mfn2前、轉(zhuǎn)染后第1天、第3天細(xì)胞數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染后第5天、第7天細(xì)胞數(shù)量均少于轉(zhuǎn)染前(P<0.05)。由此看出Mfn2能抑制干細(xì)胞的增殖。文獻(xiàn)報(bào)道顯示[7]：Mfn2基因通常位于染色體36.22位置，發(fā)病后常呈缺失、易位等，有望成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)。本研究中，轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63組和轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干細(xì)胞組的小鼠骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移均較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤干細(xì)胞組和空白組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干細(xì)胞組的小鼠骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移較轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63組和空白對(duì)照骨肉瘤MG63組均較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1骨肉瘤干細(xì)胞組和空白對(duì)照骨肉瘤干細(xì)胞組骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移率低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此看出Mfn2能抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、分化，能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，能為骨肉瘤臨床治療提供新的靶點(diǎn)，均需要進(jìn)一步研究和探討[8]。由此可見，基因靶向治療骨肉瘤是目前治療骨肉瘤的一個(gè)突破點(diǎn)[9-10]。

綜上所述，Mfn2屬于是一種抑癌基因，能抑制骨肉瘤及其干細(xì)胞增殖能力，并且能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，能為臨床骨肉瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

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