康 帥，林 芳，穆向榮，連超杰，馬雙成＊＊

（1.中國食品藥品檢定研究院 北京 100050；2.株洲市食品藥品檢驗所 株洲 412008；3.山東省食品藥品檢驗研究院 濟南 250101）

牛黃是我國傳統(tǒng)珍貴藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品?！吨腥A人民共和國藥典》2015版（簡稱《中國藥典》）規(guī)定其來源為?？苿游锱os taurus domesticus Gmelin的干燥膽結(jié)石，具有清心、豁痰、開竅、涼肝、息風、解毒之功效[1]?，F(xiàn)代研究表明牛黃含膽酸、膽固醇、膽紅素等有效成分[2]。牛黃是中醫(yī)常用清心開竅藥物，在中成藥及臨床調(diào)劑中用量較大。以牛黃為主要原料的安宮牛黃丸廣泛用于多種原因引起的熱病神昏等癥，是中醫(yī)急癥用藥[3～4]。由于本品藥源稀缺，價格昂貴，摻偽假造現(xiàn)象屢見不鮮，如曾有報道用駱駝黃、熊膽黃、豬膽黃等偽充牛黃使用的現(xiàn)象[5～8]?！吨袊幍洹分信｜S的鑒別方法也從“烏金衣”、“分層”、“環(huán)紋”等性狀特征，以及“掛甲”的經(jīng)驗鑒別方法，發(fā)展到粉末顯微特征、以及控制膽酸、膽紅素等成分的薄層色譜鑒別方法[1]。近期筆者發(fā)現(xiàn)一種偽品，外觀與牛黃近似。經(jīng)鑒定，為淀粉和色素制作而成，未見有相關(guān)文獻報道。本文首先從性狀和顯微鑒別特征入手，對牛黃與其偽品進行了鑒別，進而通過高效液相色譜實驗對染色物質(zhì)進行了定性，并應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用方法對染色物質(zhì)做了進一步的確認。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Canon 5D2照相機；Olympus BX51型透射光顯微鏡及DP71型CCD成像系統(tǒng)；Zeizz Stereo Lumar V12型體式熒光顯微鏡及Axiocam 506 color成像系統(tǒng)；AISITE型水浴鍋；Agilent 1260高效液相色譜儀（G1315D二極管陣列檢測器，美國Agilent公司）；Agilent 1200 LC/AB Sciex Qtrap 4500 MS高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司/美國AB公司）；AG-135電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；KS-300E超聲波清洗器（寧波科生儀器廠）。

1.2 試藥

水合氯醛（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W工業(yè)公司）；一級水(自制，電阻率值為18.2 MΩ.cm)；甲醇（色譜純）德國MERCK公司；其它試劑均為分析純。

1.3 對照品

胭脂紅（批號：111771-201302）；檸檬黃（批號：510004-201602，含量：89.6%）；金橙Ⅱ（批號：111769-201302，）；金胺O（批號：111770-201302）；偶氮玉紅（批號：520054-201401）；酸性紅73（111773-201602）；日落黃（批號：510005-201602，含量：86.9%）。以上標準物質(zhì)均購于中國食品藥品檢定研究院。皂黃（批號：20170508），購于上海邁坤化工有限公司。

2 實驗樣品

實驗用牛黃正品藥材為2005年6月于北京收集；牛黃偽品為2017年1月于四川省成都市收集。實驗樣品均保存于中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所標本館。

3 性狀和顯微鑒別

3.1 實驗方法

觀察樣品宏觀性狀特征，采用Zeizz Stereo Lumar V12型體式顯微鏡及Axiocam 506 color成像系統(tǒng)觀察和記錄其微觀形態(tài)特征。選取牛黃與其偽品，粉碎后取粉末加水合氯醛試液，置Olympus BX51型透射光顯微鏡下觀察。

3.2 實驗結(jié)果

3.2.1 性狀（見圖1）

3.2.1.1 牛黃

呈卵形或類球形，有完整的，也有破碎成碎瓣的。直徑約2-3 cm。表面黃紅色至棕黃色，深淺不一，細膩而稍有光澤；有時外部掛有一層黑色光亮的薄膜，俗稱“烏金衣”；有的表面有龜裂紋，亦有呈麻面而不光滑并顏色較深者。體輕，質(zhì)酥脆，易分層剝落，斷面棕黃色或金黃色，深淺不等，亦顯光澤，有間隔均勻呈環(huán)形排列整齊的同心層紋，有的夾有白心，掰開放大觀察，白心呈結(jié)晶狀。

3.2.1.2 偽品

亦呈卵形或類球形。直徑4-5 cm。表面金黃色至黃棕色，粗糙而無光澤；表面有龜裂紋，并有小孔散布。體輕，質(zhì)酥脆，易分層剝落，斷面棕黃色，無光澤，具模糊層紋，掰開放大觀察，白心不呈結(jié)晶狀。

3.2.2 顯微（見圖2）

3.2.2.1 牛黃

不規(guī)則團塊由多數(shù)黃棕色或棕紅色小顆粒集成，稍放置，色素迅速溶解，并顯鮮明金黃色。

3.2.2.2 偽品

可見迅速溶解的色素團及大量淀粉粒存在，淀粉粒在偏光下十字交叉紋理較為明顯。

4 偽品染色物質(zhì)的鑒定

4.1 實驗方法

4.1.1 HPLC-DAD法

4.1.1.1 色譜條件

圖1 牛黃與其偽品性狀特征比較

圖2 牛黃與其偽品顯微特征比較

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×150 mm,5 μm）；流動相A：甲醇；流動相B：0.01 mol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫條件：按表1進行梯度洗脫；柱溫25℃；流速：1.0 ml/min；二極管陣列檢測器檢測波長：430 nm；二極管陣列檢測器檢測波長范圍：190～800 nm。

4.1.1.2 供試品溶液制備

分別取牛黃與其偽品的粉末0.1 g，加70%乙醇20 ml，超聲處理20分鐘，離心，取上清液作為供試品溶液。

4.1.1.3 對照品溶液的制備

分別取檸檬黃、胭脂紅、金胺O、金橙Ⅱ、皂黃五種對照品適量，加甲醇制成每1 ml含檸檬黃60 μg、胭脂紅60 μg、金胺O 15 μg、金橙Ⅱ30 μg、皂黃30 μg的對照品溶液。

4.1.1.4 樣品測定

取空白溶液、牛黃正品供試品溶液、牛黃偽品供試品溶液，以及對照品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

4.1.2 HPLC-MS法

4.1.2.1 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為Xtimate TM C18（4.6×150 mm，5 μm）；流動相A：甲醇；流動相B：0.01 mol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫條件：按表2進行梯度洗脫；流速：0.4 ml/min；進樣體積：5 μl；質(zhì)譜條件為離子源：電噴霧ESI離子源，電離方式：ESI+；電噴霧電壓：4500 V；離子源溫度：500℃；載氣流速：15 L/min。掃描方式：進行一級質(zhì)譜全掃描、二級質(zhì)譜全掃描，掃描范圍m/z100-600，具體MS參數(shù)見表2。

4.1.2.2 供試品溶液制備

同4.1.1.2

4.1.2.3 對照品溶液的制備

同4.1.1.3

表1 HPLC-DAD梯度洗脫條件

表2 HPLC-MS梯度洗脫條件

表3 化合物的基本信息及MS參數(shù)

4.1.2.4 樣品測定

取空白溶液、牛黃正品供試品溶液、牛黃偽品供試品溶液，對照品溶液分別稀釋適當?shù)谋稊?shù)后進樣，進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

4.2 實驗結(jié)果

4.2.1 HPLC-DAD法結(jié)果

結(jié)果表明僅牛黃偽品供試品溶液中呈現(xiàn)與檸檬黃、胭脂紅、金胺O、金橙Ⅱ、皂黃對照品溶液保留時間一致的色譜峰（見圖3）。且對照品和供試品中各色譜峰在190～800 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜相同（供試品的紫外-可見吸收光譜見圖4）。檸檬黃、胭脂紅、金橙Ⅱ、皂黃、金胺O的最大吸收波長分別為430 nm、510 nm、486 nm、422 nm、436 nm。

圖3 牛黃與其偽品色譜結(jié)果

圖4-1 五種對照試劑色譜峰對應(yīng)的光譜

圖4-2 牛黃偽品供試品各色譜峰對應(yīng)的光譜圖

4.2.2 HPLC-MS法結(jié)果

在一級全掃描質(zhì)譜圖中，牛黃偽品出現(xiàn)與檸檬黃、胭脂紅、金胺O、金橙Ⅱ、皂黃對照試劑相同的準分子離子峰；在二級全掃描質(zhì)譜圖中，牛黃偽品出現(xiàn)與檸檬黃、胭脂紅、金胺O、金橙Ⅱ、皂黃對照試劑相同的離子碎片特征峰，進一步確證了牛黃偽品供試品種中添加有上述五種色素（一級、二級質(zhì)譜圖見圖5）。檸檬黃的準分子離子[M-3Na+4H]+峰為m/z469，其二級全掃描質(zhì)譜的特征離子碎片為451.0、200.0、406.9；胭脂紅的準分子離子[M-3Na+4H]+峰為m/z539,其二級全掃描質(zhì)譜的特征離子碎片為 233.0、158.0、520.9、316.0、457.0；金胺O的準分子離子[M-Cl-]+峰為m/z268，其二級全掃描質(zhì)譜的特征離子碎片為147.1、252.1、107.0；金橙Ⅱ的準分子離子[M-Na++2H+]+峰為m/z329，其二級全掃描質(zhì)譜的特征離子碎片為156.0、312.0、173.0；皂黃的準分子離子[M-Na++2H+]+峰為m/z329，其二級全掃描質(zhì)譜的特征離子碎片為169.1、109.0。

圖5-1 對照試劑一級質(zhì)譜圖

圖5-2 牛黃偽品的一級質(zhì)譜圖

5 討論

5.1 偽品的鑒別

由于牛黃屬于貴細中藥材，因此市場上摻偽造假等現(xiàn)象屢見不鮮，但未有直接用色素和淀粉造假充偽的相關(guān)文獻報道。本文報道的這種偽品與牛黃在外觀顏色、分層及白心等特征較為接近。但借助體式顯微鏡，可以發(fā)現(xiàn)兩者在分層環(huán)紋結(jié)構(gòu)、表面光澤及白心形態(tài)等細微形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在一定差異。并且應(yīng)用光學顯微鏡可以更加明顯的觀察到偽品中淀粉粒的特征，初步判斷了色素的存在。從宏觀到微觀層級遞進的觀察方法是鑒別藥材真?zhèn)蔚谋匾緩健?/p>

5.2 染色物質(zhì)的鑒定

圖5-3 對照試劑二級質(zhì)譜圖

圖5-4 牛黃偽品的二級質(zhì)譜圖

5.2.1 以前文獻報道的牛黃與其偽品的鑒別多停留在外觀性狀特征上[5～8]。在顯微觀察發(fā)現(xiàn)偽品中摻有大量色素之后，筆者參考藥品補充檢驗方法＊＊＊，＊＊＊＊及方法中的色素種類，根據(jù)樣品表面金黃色至黃棕色，斷面棕黃色，溶解于水中的顏色為橙色，顯微顯紅色，故首先應(yīng)用薄層色譜方法對行業(yè)內(nèi)已有報道的偶氮玉紅、酸性紅73、日落黃、檸檬黃、胭脂紅、金胺O、金橙Ⅱ和皂黃8種染色物質(zhì)進行了初篩，并在偽品供試品中檢測到金胺O、皂黃等5種染色物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻報道的方法[9～12]，應(yīng)用了HPLC-DAD和HPLC-MS的方法對偽品中染色物質(zhì)做了進一步的確認和證實。并且從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)偽品中以金胺O、皂黃和金橙Ⅱ為主要染色物質(zhì)。

5.2.2 檸檬黃、皂黃、金胺O的最大吸收波長分別為：430 nm、422 nm、436 nm，且在430 nm處胭脂紅和金橙Ⅱ也有較大的吸收，故HPLC-DAD法檢測波長選擇430 nm。

5.2.3 對牛黃偽品測定的同時，對牛黃正品和空白試劑也進行了考察，牛黃正品溶液和空白試劑在相應(yīng)色素色譜峰位置均不干擾色素的測定，表明本文建立對五種色素檢測的HPLC-DAD法和HPLC-MS法專屬性良好。

5.3 多技術(shù)結(jié)合用于中藥監(jiān)管與檢驗

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中藥使用量也在逐年猛增，藥材資源不斷減少，大部分品種的栽培養(yǎng)殖供應(yīng)不足，進而導(dǎo)致藥材制假造假、摻偽染色現(xiàn)象層出不窮，中藥的質(zhì)量和安全問題也越來引起各方面的重視。當前，摻偽造假手段在不斷變化，筆者認為任何一種鑒別手段都不可能十全十美，往往需要多技術(shù)的結(jié)合和互相驗證才能得出較為準確的結(jié)論。本文以牛黃與其偽品的鑒別為例，開展了多種技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于中藥材真?zhèn)舞b別的方法研究。牛黃偽品不僅沒有療效，其中摻有的染色物質(zhì)均有一定的毒性報道，存在較大的安全隱患[13～17]。因此，應(yīng)加強對中藥材、中藥飲片摻偽造假等問題檢驗方法的研究，多技術(shù)綜合運用，為中藥監(jiān)督與檢驗提供科學準確的參考依據(jù)，保證人民群眾用藥安全有效。

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