朱虹宇，李紅品，高 興，馬鵬凱，陳建華，畢欣寧，汪 祺，張玉杰＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京 102488；2.中國食品藥品檢定研究院 北京 100050）

中藥成分及作用機制復雜，傳統(tǒng)的藥理學研究很難從系統(tǒng)層面闡述其藥理機制，網絡藥理學的研究方法已成為揭示中藥復方治療疾病的分子機制的新途徑。網絡藥理學可以系統(tǒng)地觀察藥物對疾病的干預和影響，與中藥及方劑多成分、多途徑、多靶點治療疾病的原理不謀而合，目前已得到中醫(yī)藥研究者的廣泛關注。近幾年以來，借助網絡藥理學探討中藥異病同治的研究也逐漸出現。蔡菲菲等[1]采用網絡藥理學的方法，探討茵陳蒿湯對濕熱癥型疾病異病同治的作用機制；趙振宇等[2]構建“疾病-靶點”及“藥物-靶點”網絡，解釋柴胡治療25種情志疾病的機制。這些研究為我們探究異病同治的機制提供了參考。

交泰丸出自《韓氏醫(yī)通》，由黃連和肉桂兩味藥以10∶1組成，主要治療因心腎不交引起的失眠不寐[3]。近年來越來越多的臨床實踐發(fā)現交泰丸不僅對失眠具有良好的治療作用[4]，還可用于對抑郁、更年期綜合征、糖尿病、皮膚病及口腔潰瘍等疾病的治療[5]，其中對糖尿病和抑郁的治療作用尤為人們所關注。但交泰丸這種異病同治的內在分子作用機制目前還鮮有研究報道。本研究通過對交泰丸相關成分及靶點進行挖掘，利用網絡藥理學分析方法，對交泰丸治療糖尿病、抑郁及失眠的靶點和機制進行初步研究探索，旨在發(fā)現交泰丸的物質基礎，明確其作用靶點，探索異病同治規(guī)律及機制。

1 實驗材料

1.1 數據庫和分析工具

中藥系統(tǒng)藥理學技術平臺（TCMSP)（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；TCM Database@Taiwan數據庫（http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/index.php）；STITCH數據庫（stitch.embl.de/）；UniProt數據庫（http://www.uni-prot.org/）；Therapeutic Target數據庫（https://db.idrblab.org/ttd/）；Comparative Toxicogenomics數據庫（http://ctdbase.org/）；MAS 3.0分子注釋系統(tǒng)（http://mas.capitalbiotech.com/mas3/）；Cytoscape軟件3.6.0。

2 實驗方法

2.1 成分篩選

通過TCMSP和TCM Database@Taiwan以及文獻檢索獲得黃連、肉桂化學成分信息。選取口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18的化合物作為候選化合物。

2.2 靶點獲取

從TCMSP數據庫和STITCH數據庫獲得候選化合物對應的靶點信息。并使用UniProt數據庫，輸入靶點名稱，限定物種為人，將靶點轉換成相應的基因。

2.3 疾病治療靶點

搜尋Therapeutic Target數據庫和Comparative Toxicogenomics數據庫中與糖尿病、抑郁和失眠相關的靶點，與藥物作用靶點進行匹配。

2.4 網絡構建

將上述候選化合物、靶點、疾病作為節(jié)點，利用Cytoscape軟件構建相互作用網絡模型。

2.5 靶點通路注釋

通過MAS對靶點進行gene ontology（GO）生物過程（biological process）富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路注釋富集分析。

3 實驗結果

3.1 交泰丸化學成分篩選

經查閱數據庫和檢索文獻，并結合其ADME性質，共篩選出黃連（HL）和肉桂（RG）中滿足條件的20個化合物，見表1。其中，桂皮醛和肉桂酸的OB和DL較低，但在肉桂中含量豐富，依然列入候選化合物。

表1 交泰丸經篩選得到的候選化合物

3.2 疾病靶點的預測

從TCMSP數據庫和STITCH數據庫整理出交泰丸的潛在靶點，從Therapeutic Target數據庫和Comparative Toxicogenomics數據庫中得到與抑郁、失眠和糖尿病相關的靶點，將二者進行匹配，分別得到交泰丸治療抑郁、失眠和糖尿病的靶點共92個（表2）。并通過Cytoscape軟件繪制化合物-靶點-疾病相互作用網絡圖（圖1）和靶點-疾病網絡圖（圖2）。圖中綠色節(jié)點代表化合物，藍色節(jié)點代表化合物作用的靶點，紅色節(jié)點代表疾病。從圖1化合物-靶點-疾病相互作用網絡圖可以看出，交泰丸的有效成分大多對應多于一個以上的靶點，而同一靶點也多會對應多個成分，交泰丸治療疾病是通過多個成分作用于多個靶點產生效應。其中靶點環(huán)氧合酶2（PTGS2）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1）、內皮型一氧化氮合酶（NOS3）、誘導型一氧化氮合酶（NOS2）、熱休克蛋白 90β（HSP90AB1）、雄激素受體（AR）、雌激素受體（ESR1）、半胱天冬酶-3（CASP3）、γ-氨基丁酸受體α1（GABRA1）、轉錄因子p65（RELA）對應的成分最多。從圖2靶點-疾病網絡圖可以看出，交泰丸作用的一些靶點是疾病特有的，而環(huán)氧合酶2（PTGS2）、對氧磷酶1（PON1）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3B）、α2C去甲腎上腺素受體（ADRA2C）、白細胞介素6（IL6）、α1A去甲腎上腺素受體（ADRA1A）、銅鋅超氧化物歧化酶（SOD1）、過氧化物酶（MPO）、白細胞介素2（IL2）是交泰丸治療糖尿病和抑郁的共同靶點，γ-氨基丁酸受體α1（GABRA1）、5-HT轉運體（SLC6A4）是交泰丸治療失眠和抑郁的共同靶點，5-HT2A受體（HTR2A）和5-HT2C受體（HTR2C）則是交泰丸治療三種疾病的共同靶點。

表2 交泰丸靶點信息

圖1 交泰丸化合物-靶點-疾病作用網絡圖

圖2 靶點-疾病網絡圖

3.3 靶點生物學分析

對交泰丸治療糖尿病、抑郁和失眠的靶點分別進行GO中的生物過程富集分析和KEGG通路注釋富集分析。交泰丸治療糖尿病、抑郁和失眠的靶點分別富集在728、186和34個生物過程（P＜0.05）。根據P值大小，圖中分別列舉了排在前10的條目（圖3）。由圖3可以看出，交泰丸治療糖尿病的靶點主要富集在抗細胞凋亡、應對缺氧、炎癥反應、信號轉導、一氧化氮生物合成的正調節(jié)等生物過程；治療抑郁的靶點主要富集在信號轉導、氧化還原、單胺轉運、抗細胞凋亡、5-羥色胺受體，磷脂酶C激活途徑等生物過程；治療失眠的靶點主要富集在5-羥色胺受體，磷脂酶C激活途徑、血管收縮的正調節(jié)、藥物反應、突觸傳導、γ-氨基丁酸分泌的正調節(jié)等生物過程。交泰丸治療糖尿病、抑郁和失眠的靶點分別富集在75、33和4條通路（P＜0.05）。根據P值大小，圖中列舉了排在前10的KEGG條目（圖4）。由圖4可以看出，交泰丸治療糖尿病的作用靶點涉及Toll樣受體信號通路、細胞因子受體相互作用、細胞凋亡等通路；治療抑郁的作用靶點涉及神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、苯丙氨酸代謝等通路；治療失眠的作用靶點涉及神經活性配體-受體相互作用、間隙連接、鈣信號通路等通路。由此可見，交泰丸治療這三種疾病對應的靶點參與的生物過程和通路既存在相似性，也存在差異性。

圖3 GO生物過程富集分析（A.糖尿病B.抑郁C.失眠）

圖4 KEGG富集分析（A.糖尿病B.抑郁C.失眠）

4 討論

糖尿病作為當今社會常見的疾病，其患者往往易產生心理疾病，如失眠、抑郁[6,7]，嚴重影響著人們的生活質量，而抑郁及睡眠問題同樣增加了糖尿病患病風險[8-10]。由此可見，這幾種疾病互相影響，互為疾病與疾病風險因素。中醫(yī)認為糖尿病、抑郁和失眠皆與心火、腎水失去協(xié)調既濟有關[11,12]。交泰丸方中黃連清瀉亢盛之心火，肉桂補火助陽，引火歸原，兩藥配伍，使得心腎相交，水火相濟[5]。可見，交泰丸對糖尿病、抑郁和失眠的異病同治具有堅實的中醫(yī)理論基礎。而且，前期的臨床研究及動物實驗也證實了交泰丸對治療這三種疾病具有明顯的改善作用[5,13]。本研究采用網絡藥理學的方法對交泰丸異病同治的作用機制進行探討。

我們的網絡藥理學分析結果顯示，HTR2A和HTR2C作為5-羥色胺（5-HT）受體，是糖尿病、失眠和抑郁三種疾病共同的治療靶點。5-HT是一種廣泛存在于中樞神經系統(tǒng)和外周神經系統(tǒng)的神經遞質，5-HT通過作用于其受體產生生理效應，涉及抑郁、睡眠與覺醒的調節(jié)[14,15]。5-HT系統(tǒng)在一些心血管疾病的發(fā)病機制中也起著重要的作用。糖尿病狀態(tài)下，5-HT的濃度及其受體都發(fā)生了改變，導致內皮損傷，進而產生或加劇糖尿病心血管并發(fā)癥[16]。本研究的結果說明，糖尿病、抑郁、失眠的發(fā)生發(fā)展存在與5-HT病理改變相關的共同機制，交泰丸可能主要是通過對共同靶點HTR2A和HTR2C的調控發(fā)揮治療糖尿病、抑郁、失眠的作用。

而且，本研究結果顯示，靶點環(huán)氧合酶2（PTGS2）對應最多的化合物，表明交泰丸有較多的化合物能夠對PTGS2產生調節(jié)作用。PTGS2是誘導型酶，催化前列腺素的生成，前列腺素是主要的炎性介質之一[17]。已有研究證實PTGS2與糖尿病和抑郁均有密切的關系[18,19]。提示PTGS2是交泰丸對糖尿病、抑郁產生治療作用的重要靶點。

前期研究報道交泰丸能夠調控失眠、抑郁大鼠神經遞質的含量，如5-HT、去甲腎上腺素（NE）、γ-氨基丁酸（GABA），發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的作用[20-22]，我們預測的靶點也發(fā)現交泰丸可作用于單胺氧化酶A（MAOA）、單胺氧化酶B（MAOB），這兩種酶可分解單胺類神經遞質[23]，從而改變單胺類神經遞質的含量。另外，預測發(fā)現神經遞質相應的受體及轉運體，如GABA受體α1亞單位（GABRA1），也是交泰丸發(fā)揮治療失眠、抑郁的靶點。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）具有多種生物學功能，如促進脂肪細胞分化和生成、增強機體對胰島素的敏感性、參與體內糖平衡的調節(jié)等，在糖尿病脂代謝研究中占據重要地位[24]。已有研究證實，交泰丸可改善2型糖尿病db/db小鼠糖尿病癥狀，上調PPARγ的基因表達，修復腎損傷[25]，這與預測的結果相一致。

由GO中的生物過程富集分析和KEGG通路注釋富集分析結果可知，交泰丸是通過多種生物過程和通路發(fā)揮治療作用。交泰丸治療糖尿病的靶點主要富集在抗細胞凋亡生物過程和Toll樣受體信號通路。細胞凋亡是細胞自主有序的主動死亡，是機體的正常生理過程。在糖尿病及糖尿病心肌病、糖尿病視網膜病變等并發(fā)癥中，細胞凋亡這一生物過程均發(fā)生異常[26-29]。已有實驗證實交泰丸可減少糖尿病大鼠胰島細胞、視網膜血管內皮細胞的凋亡，從而改善糖尿病以及糖尿病視網膜病變[30,31]，這與我們的預測結果相一致。Toll樣受體激活后通過髓樣分化因子88依賴和髓樣分化因子88非依賴途徑，引起核因子（NF）-κB活化，炎性因子分泌增加，Toll樣受體信號通路也介導了糖尿病及糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變等并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[32,33]。交泰丸治療抑郁的靶點主要富集在信號轉導生物過程和神經活性配體-受體相互作用通路。信號轉導通過級聯(lián)放大作用完成信息的傳遞，產生生物學效應。神經細胞內有多個信號轉導通路組成的網絡，各通路協(xié)調發(fā)揮作用，細胞才能做出及時而準確的反應，抑郁癥患者神經細胞的信號轉導也存在異常[34]。神經活性配體-受體相互作用通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合，與神經功能最為密切[35]。交泰丸治療失眠的靶點主要富集在5-羥色胺受體，磷脂酶C激活途徑生物過程和神經活性配體-受體相互作用通路。5-HT2受體可通過Gq蛋白激活磷脂酶C，促進磷脂酰肌醇代謝。有研究表明，5-HT2A/2C受體-磷脂酶C的激活易化大鼠杏仁核的突觸可塑性[36]。由此推測，交泰丸可能通過這些生物過程和通路分別發(fā)揮對糖尿病、抑郁及失眠的治療作用。

5 結語

本研究采用網絡藥理學的研究方法，從分子網絡水平研究了交泰丸對糖尿病、失眠、抑郁的調控作用。研究表明，交泰丸中的20個化合物可作用于92個靶點發(fā)揮對3種疾病的治療作用，交泰丸對糖尿病、抑郁、失眠的治療既存在共同的靶點，又能通過各個疾病特有的靶點發(fā)揮作用。經生物信息富集分析發(fā)現，交泰丸治療糖尿病、抑郁和失眠的靶點分別富集在728、186和34個生物過程以及75、33和4條通路。該研究體現了交泰丸具有多成分、多靶點、多途徑的特點，可為進一步研究交泰丸的作用機制提供參考，為臨床上的合理應用和新藥開發(fā)提供依據。該方法存在一定的局限性，只能為我們提供初步的探索，后期仍需實驗進行進一步驗證。

1 蔡菲菲,李曉燕,董姝,等.基于網絡藥理學的茵陳蒿湯“異病同治”研究.世界科學技術:中醫(yī)藥現代化,2016,18(9):1507-1514.

2 趙振宇,沈霞,胡本祥,等.基于系統(tǒng)藥理學研究柴胡治療情志疾病異病同治的機制.中國藥學雜志,2016,51(13):1131-1136.

3 高伯正.交泰丸釋名.光明中醫(yī)雜志,1996,(6):6-7.

4 張煥萍.交泰丸加減治療心腎不交型失眠32例.內蒙古醫(yī)學雜志,2009,41(S2):61.

5 周志煥,高杉,李琳,等.交泰丸臨床及藥理研究述要.天津中醫(yī)藥,2014,31(3):190-192.

6 王芳.糖尿病、失眠與精神心理因素的關系及中醫(yī)的認識.國際中醫(yī)中藥雜志,2009,31(3):256-258.

7 王蓓蕾,洪肖娟,黃家興,等.針灸治療糖尿病抑郁的臨床研究進展.湖南中醫(yī)雜志,2016,32(3):182-185.

8 Cappuccio F P,D'Elia L,Strazzullo P,et al.Quantity and quality of sleep and incidence of type 2 diabetes:a systematic review and metaanalysis.Diabetes Care,2010,33(2):414-420.

9 李佳琦,嚴悅蓉,余葉蓉.睡眠障礙與糖尿病的關系及其對糖代謝的影響研究進展.中國全科醫(yī)學,2017,20(11):1300-1304.

10 Knol M J,Twisk J W,Beekman A T,et al.Depression as a risk factor for the onset of type 2 diabetes mellitus.A meta-analysis.Diabetologia,2006,49(5):837.

11 高樹明,李沛純,楊帥,等.試從心腎不交論交泰丸臨床辨治.天津中醫(yī)藥大學學報,2016,35(2):73-76.

12 張建永,張濱,段燦燦.交泰丸治療糖尿病的理論基礎及應用.世界中醫(yī)藥,2016,11(3):554-557.

13 全世建,王紅丹,劉彥鳳.交泰丸化學成分及藥理作用的研究進展.河南中醫(yī)學院學報,2007,22(4):83-84.

14 秦娟娟,劉振華,梁艷,等.5-羥色胺及其受體與抑郁癥.國際藥學研究雜志,2012,39(5):409-413.

15 楊岑,冉明梓,歐陽鵬榮,等.五羥色胺在睡眠-覺醒中作用.現代生物醫(yī)學進展,2015,15(11):2191-2194.

16 García-Pedraza J á,Ferreira-Santos P,Aparicio R,et al.Blocking 5-HT2 receptor restores cardiovascular disorders in type 1 experimental diabetes.Sci Rep,2016,6:33979.

17 蔣延超,蔣世云,傅鳳鳴,等.雞血藤中黃酮類化合物與環(huán)氧合酶-2對接研究.天然產物研究與開發(fā),2015,27(5):809-815.

18 Ga?ecki P P,Talarowska M,Bobińska K,et al.COX-2 gene expression is correlated with cognitive function in recurrent depressive disorder.Psychiatry Res,2014,215(2):488-490.

19 Szerafin T,Erdei N,Fül?p T,et al.Increased cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin-mediated dilation in coronary arterioles of patients with diabetes mellitus.Circ Res,2006,99(5):e12-17.

20 余運龍,全世建.交泰丸對PCPA大鼠下丘腦5-HT、NE的影響.時珍國醫(yī)國藥,2011,22(11):2803-2804.

21 楊帥,潘曄,宋彥奇,等.交泰丸對抑郁大鼠行為學及腦內單胺類神經遞質的影響.中草藥,2016,47(23):4218-4223.

22 余運龍,全世建.交泰丸對PCPA失眠大鼠大腦γ-氨基丁酸及受體的影響.時珍國醫(yī)國藥,2010,21(06):1417-1418.

23 張娜.單胺氧化酶抑制劑治療神經退行性疾病的研究進展.醫(yī)學理論與實踐,2015,28(13):1713-1715+1718.

24 呂妍,徐金娥.PPAR與糖尿病脂代謝的相關性.齊魯醫(yī)學雜志,2013,28(3):277-279.

25 胡娜,袁琳,李慧姣,等.交泰丸對db/db小鼠腎臟的保護作用及脂肪組織PPARγ基因表達調節(jié)作用的實驗研究.中國中醫(yī)藥科技,2017,24(5):567-571.

26 Sun X,Chen R,Yang Z,et al.Taxifolin prevents diabetic cardiomyopathy in vivo and in vitro by inhibition of oxidative stress and cell apoptosis.Food Chem Toxicol,2014,63:221-232.

27 Wu Y,Chen Y,Wu Q,et al.Minocycline inhibits PARP-1 expression and decreases apoptosis in diabetic retinopathy.Molecular medicine reports,2015,12(4):4887-4894.

28 Anuradha R,Saraswati M,Kumar K G,et al.Apoptosis of beta cells in diabetes mellitus.DNA and cell biology,2014,33(11):743-748.

29 宋春雨,杜聯(lián).論糖尿病及糖尿病并發(fā)癥與細胞凋亡關系.遼寧中醫(yī)藥大學學報,2015,17(11):71-73.

30 鄒欣,劉德亮,陸付耳,等.交泰丸對2型糖尿病大鼠胰腺脂肪沉積和胰島細胞凋亡的影響.中國中藥雜志,2014,39(11):2106-2111.

31 羅旭異,高健生,潘琳.交泰丸對鏈脲佐菌素性糖尿病大鼠視網膜血管病理改變的作用.中國中醫(yī)眼科雜志,2007,17(1):27-31.

32 吳珺,魯一兵,劉超.Toll樣受體和糖尿病.國際內分泌代謝雜志,2008,28(2):116-118.

33 吳冕,陳海冰.Toll樣受體與2型糖尿病及其并發(fā)癥的關系及分子機制.醫(yī)學綜述,2013,19(20):3754-3757.

34 徐向青,唐啟盛.抑郁癥與細胞信號轉導研究進展.中國醫(yī)藥導報,2012,9(36):49-50.

35 潘玲珍.蜘蛛香藥物依賴性評價的毒理基因組學研究.成都:西南交通大學,2011.

36 陳愛琴,陳曉春,周瑞祥,等.5-HT2受體-磷脂酶C的激活易化大鼠基底外側杏仁核突觸可塑性的研究.神經解剖學雜志,2008,24(5):529-532.