， ，， ，，

棘球蚴病(echinococcosis)也稱包蟲病(hydatid disease)，主要是由棘球絳蟲的幼蟲棘球蚴 (或稱包蟲)寄生于人體或食草動(dòng)物臟器所引起的人獸共患寄生蟲病。在目前已知的幾種棘球絳蟲中對(duì)人危害較嚴(yán)重的是細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)和多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)，其分別引起囊型包蟲病(cystic echinococcosis, CE)和泡型包蟲病(alveolar echinococcosis, AE)。人是棘球絳蟲的中間宿主，人誤食棘球絳蟲蟲卵污染的蔬菜或水后，蟲卵在十二指腸內(nèi)孵出六鉤蚴，六鉤蚴可穿過腸壁進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，進(jìn)而遷移到全身各器官發(fā)育為棘球蚴，最終發(fā)育成為單個(gè)包囊(單房棘球蚴，也稱棘球蚴)或由無數(shù)個(gè)小囊泡相互連接聚集而成的囊泡狀團(tuán)塊(多房棘球蚴，也稱泡球蚴)。CE流行范圍較AE廣泛，但AE的致病性比CE更為嚴(yán)重，因可呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，素有“惡性包蟲病”或“蟲癌”之稱，如果不采取有效的治療措施，10年死亡率達(dá)90%以上[1]。

手術(shù)切除是治療包蟲病的首選方法，但大多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)到了中晚期，只能選擇藥物治療[2-4]。目前，治療包蟲病的主要藥物為阿苯達(dá)唑和甲苯咪唑，由于包蟲囊壁較厚，藥物的通透性差，長(zhǎng)期服用有很大的副作用，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生耐藥性[5-7]。因此，探尋棘球蚴病治療新靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

水通道蛋白(aquaporin, AQP)，又叫水孔蛋白或親水孔蛋白，是普遍存在于生物體細(xì)胞膜上的一類能促進(jìn)水、甘油、尿素等小分子溶劑運(yùn)輸?shù)哪ねǖ赖鞍?，屬于主要?nèi)在蛋白(major intrinsic protein, MIP)超家族[8]。根據(jù)功能及結(jié)構(gòu)特性，AQPs可分為專一性水通道蛋白亞族(只允許水分子通過)和水-甘油水通道蛋白亞族(除了水分子，還允許甘油、尿素等小分子通過)[9]。水通道蛋白多肽鏈的N和C末端位于細(xì)胞質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)[10]，具有6個(gè)跨膜螺旋，由A～E5個(gè)環(huán)連接，B環(huán)和E環(huán)上的NPA基序在不同AQPs中高度保守，是AQPs通透水分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[11]。AQPs不僅對(duì)寄生蟲維持和調(diào)節(jié)滲透壓具有重要作用，還參與寄生蟲營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝產(chǎn)物排出等生理過程，研究發(fā)現(xiàn)寄生蟲AQPs還可以參與抗寄生蟲藥物的運(yùn)輸[12-14]。

棘球蚴與泡球蚴分別是單房棘球蚴與多房棘球蚴的簡(jiǎn)稱。單房棘球蚴主要由囊壁和囊內(nèi)容物組成(包括囊液、原頭蚴、囊砂等)。單房棘球蚴囊壁分內(nèi)、外兩層，外層為角皮層，內(nèi)層為生發(fā)層(亦稱胚層，具有旺盛的增殖能力)，囊液為無色透明或淡黃色的水樣液體。多房棘球蚴與單房棘球蚴有所不同，形態(tài)上由許多小的囊泡組成，而且總體上多房棘球蚴囊液比單房棘球蚴的少。目前的問題是，不管哪種棘球蚴，其囊液的來源與生成機(jī)制一直是個(gè)謎，有研究表明，棘球蚴囊液通過生發(fā)層細(xì)胞膜的滲透水通透系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其簡(jiǎn)單擴(kuò)散通過細(xì)胞膜的擴(kuò)散通透系數(shù)[15]，但一直缺乏對(duì)此結(jié)果進(jìn)行深入的原因分析。因此，本研究提出的假說是棘球蚴囊壁生發(fā)層細(xì)胞膜AQPs在囊液形成過程中發(fā)揮重要作用。

研究表明細(xì)粒棘球絳蟲基因組存在7個(gè)編碼AQPs的基因，包括EgAQP (accession number: EgrG_000125500)、EgAQP1 (accession number: EgrG_000125400)、EgAQP3 (accession number: EGR_03137)、EgAQP4 (accession number: EgrG_000125550)、EgAQPFA-CHIP (accession number: Egr_04161)、EgAQPAnG (accession number: Egr_04162)和EgAQP9 (accession number: EgrG_001190800)；多房棘球絳蟲基因組存在6個(gè)編碼AQPs的基因，包括EmAQP (accession number: EmuJ_000125500)、2個(gè)EmAQP9 (accession number: EmuJ_001190800和EmuJ_000153200)、2個(gè)EmAQP4 (accession number: EmuJ_000125600和EmuJ_000124900)和EmAQP1 (accession number: EmuJ_000125400)[16]，但對(duì)于AQPs在棘球蚴囊壁生發(fā)層上的表達(dá)及其與囊液形成關(guān)系的研究都未見報(bào)道。本研究利用RT-PCR擴(kuò)增棘球蚴AQPs基因，并在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)以驗(yàn)證其水通道功能，通過對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲AQPs的基因克隆及功能進(jìn)行比較，為闡明棘球蚴、泡球蚴囊液的形成過程以及篩選棘球蚴病新的藥物治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1寄生蟲及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 感染細(xì)粒棘球蚴的羊肝采集自新疆某屠宰場(chǎng)，通過冷鏈快遞方式運(yùn)至本實(shí)驗(yàn)室。無菌收集原頭蚴，用含有1%青-鏈霉素的無菌PBS反復(fù)清洗至能清晰觀察到原頭節(jié)自然下沉為止。清洗后的原頭蚴懸液經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后顯微鏡下觀察其活力，活力>90%時(shí)用于動(dòng)物接種。從重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買6～8周齡，健康雌性BLAB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，每只小鼠經(jīng)腹腔注射接種4 000個(gè)原頭蚴，于接種后3個(gè)月，解剖小鼠，收集囊泡，用于提取總RNA。感染泡球蚴的SD大鼠由成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室王昕教授惠贈(zèng)，嚴(yán)格無菌操作解剖大鼠，收集囊泡，用于提取總RNA。

1.2棘球蚴囊泡總RNA提取及cDNA合成 取100 mg棘球蚴囊泡裝入無酶1.5 mL EP管，用經(jīng)DEPC (diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 水處理的滅菌剪刀剪碎，加入1 mL Trizol，冰上勻漿，用于提取總RNA?？俁NA提取按RNeasy Mini Kit試劑盒說明書(康維世紀(jì)，北京)進(jìn)行。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性并用Nano Drop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度及OD260nm/OD280nm值。以各樣品1 mg總RNA為模板，利用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3棘球蚴AQPs引物合成及基因克隆 根據(jù)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲AQPs基因組序列信息，采用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)RT-PCR特異性引物，引物序列及相關(guān)信息見表1。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 棘球絳蟲AQPs基因擴(kuò)增所用引物序列及相關(guān)信息

Tab.1 Primer sequences and relative information of AQPs from Echinococcus

NameAccession numberPrimer sequences(5′ to 3′)Size of products(bp)EmAQPEmuJ_000125500F: CCGAATTCATGTTCTTGGAGGATTTGCC738R: CGC TCG AGTTTTCCACCAGTTTCTTCGGEmAQP1EmuJ_000125400F: CGG AAT TCATGCCCGGTCCTGGAGTAA657R: CGCTCGAGGCTTCTGCGTTGCTCACTCEmAQP4EmuJ_000125600F: CGGAATTCATGATCACCTTTCCTTACTTCC777R: CCC TCG AGCGCTTTGTGGGCTTTTGTATTTEmAQP4EmuJ_000124900F: CGGAATTCATGAAGAAGCCATCCTGC786R: CCC TCG AGGACACCCACATCTTCTTGEmAQP9EmuJ_001190800F: CGG AAT TCATGAAACACATCACCGA981R: CCC TCG AGAACATCTGATTCATCTCCEmAQP9EmuJ_000153200F: CGG AAT TCATGTCAGTGAGCCAAAA882R: CCC TCG AGCTTTGCCTCGCTTAAATEgAQPEgrG_000125500F: CCGAATTC ATGTTCTTGGAGGATTTGCC738R: CCC TCG AGC TCCACCAGTTTCTTCGGAGEgAQP1EgrG_000125400F: CCGAATTC ATGCCCGGTCCTGGAGTAA657R: CCC TCG AGC GCTCACTTCGCTCATCCGAEgAQP3EGR_03137F: CGG AAT TCA TGT CAG TGA GCC AAA ATA ATA ACC978R: CCC TCG AGC TTT GCC TCG CTT AAA TCEgAQP4EgrG_000125550F: CGGAATTCATGACTAAGAATCCGGTGCC801R: CCCTCGAGTCAGCTGTTCCCCAAGTCGTCAEgAQPFA-CHIPEgr_04161F: CCGAATTCATGCCGCACAGGTACCAC1050R: CCC TCG AGGCTTCTGCTAACAGACEgAQPAnGEgr_04162F: CGG AAT TCA TGT TCT TGG AGG ATT TGC CAT G717R: CCC TCG AGC TCG TCT GAT TTC GTG GEgAQP9EgrG_001190800F: CCGAATTC ATGTCAGTGAGCCAA978R: CCC TCG AGC CTTTGCCTCGCTTAA

以棘球蚴囊泡cDNA為模板，用AQPs特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL，各反應(yīng)成分分別為10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，MgCl21.5 μL，上、下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，cDNA 1.0 μL，ExTaq DNA polymerase 0.25 μL (2.5 U/μL)，ddH2O 18.25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物(5 μL)經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇片段大小與預(yù)期相符的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，用凝膠回收試劑盒(康為世紀(jì)，北京)純化后，克隆到pMD19-T質(zhì)粒(命名為pMD19-T-AQPs)，用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定，并送寶生物(大連)生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4AQPs體外轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄模板的制備 pMD19-T-AQPs質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和xhoI雙酶切后，連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和xhoI雙酶切后的pCS-107質(zhì)粒(該質(zhì)粒含有爪蟾β-珠蛋白5′和3′非編碼區(qū)，由清華大學(xué)陶慶華教授惠贈(zèng))，構(gòu)建AQPs體外轉(zhuǎn)錄載體pCS-107-AQPs。

體外轉(zhuǎn)錄載體pCS-107-AQPs經(jīng)限制性內(nèi)切酶AscI酶切，使之線性化，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit (Ambion, cat#AM1340)合成cRNA(capped RNAs)。

1.5非洲爪蟾卵母細(xì)胞顯微注射及透水系數(shù)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)用的非洲爪蟾(Xenopuslaevis)由清華大學(xué)陶慶華教授實(shí)驗(yàn)室提供，取1只成熟雌性爪蟾(未取卵)，麻醉后在卵巢位置縱向切開1個(gè)小口，用尖頭鑷子取出部分卵葉組織，放入裝有卵母細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。在顯微鏡下用尖頭鑷子剝離卵母細(xì)胞濾泡膜，選擇V或VI期卵母細(xì)胞進(jìn)行顯微注射，每顆卵母細(xì)胞注射50 nL AQPs cRNA(實(shí)驗(yàn)組)或DEPC水(對(duì)照組)，每個(gè)基因注射20顆卵母細(xì)胞。

經(jīng)顯微注射后的卵母細(xì)胞在含有1%青-鏈霉素的ND96溶液中培養(yǎng)48 h(培養(yǎng)溫度為18 ℃)后，轉(zhuǎn)入經(jīng)雙蒸水進(jìn)行1∶5稀釋的ND96溶液中，立即于攝像顯微鏡下拍照，測(cè)定時(shí)環(huán)境溫度為室溫，每2.5 min捕捉1張細(xì)胞體積變化的圖，記錄最初30 min的細(xì)胞體積變化情況。透水系數(shù)(water permeability，Pf)按下列公式計(jì)算：Pf=V0[d(V/V0)/dt]/[S0×Vw(Osmin-Osmout)]，其中Osmin為細(xì)胞內(nèi)滲透壓，Osmout為細(xì)胞外滲透壓，初始體積V0為9×10-4cm3，水分子的偏摩爾體積Vw為18 cm3/mL，初始細(xì)胞表面積S0為0.045 cm2[17]，體積按下列公式計(jì)算：V=(4/3)×S×(S/π)1/2(S為細(xì)胞表面積)。

1.6序列分析及比較 利用TMHMM Server v.2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析棘球絳蟲AQPs的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用Clustal omega軟件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對(duì)棘球絳蟲AQPs和人AQPs進(jìn)行多序列比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1棘球絳蟲AQPs基因的擴(kuò)增 細(xì)粒棘球絳蟲基因組存在7個(gè)AQPs編碼基因，但本研究以細(xì)粒棘球蚴囊泡mRNA為模板，利用AQPs特異性引物進(jìn)行RT-PCR時(shí)，只有EgAQP3、EgAQP4和EgAQP9的擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，PCR產(chǎn)物分別為978 bp、801 bp和978 bp(圖1A)；而EgAQPAnG和EgAQP的擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期不一致。遺憾的是未能擴(kuò)增出EgAQPFA-CHIP和EgAQP1基因。將AQPs的測(cè)序結(jié)果與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)里的序列進(jìn)行Blastx比對(duì)，結(jié)果表明擴(kuò)增到的EgAQP4、EgAQP3和EgAQP9序列與NCBI中相應(yīng)序列的一致性為100%；而EgAQP與細(xì)粒棘球絳蟲LETM1 and EF hand domain containing protein 1 (accession number: CDS16482)的序列一致性為98%、EgAQPAnG與多房棘球絳蟲表達(dá)蛋白(accession number: CDS35447)的序列一致性為62%。經(jīng)Blastn比對(duì)，EgAQP3和EgAQP9的序列一致性為99%，表明EgAQP3和EgAQP9可能由同一個(gè)基因編碼。

多房棘球絳蟲基因組存在6個(gè)AQPs編碼基因，但本研究只擴(kuò)增到EmAQP4(accession number: EmuJ_000124900)和EmAQP9(accession number: EmuJ_001190800)2個(gè)基因，PCR產(chǎn)物分別為786 bp和981 bp(圖1B)。將EmAQP4和EmAQP9的測(cè)序結(jié)果與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)里的序列進(jìn)行Blastx比對(duì)，結(jié)果表明擴(kuò)增到的EmAQP4和EmAQP9序列與NCBI中相應(yīng)序列的一致性為100%。

因此，本研究在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中驗(yàn)證EgAQP4、EgAQP9、EmAQP4和EmAQP9的水通道功能。

A：泳道1、3、5：DNA Ladder2000，泳道2：EgAQP3，泳道4：EgAQ4，泳道6：EgAQP9；B：泳道1、3：DNA Ladder2000，泳道2：EmAQP4，泳道4：EmAQP9。圖1 細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲AQPs基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 PCR products of AQPs of E. granulosus and E. multilocularis

2.2注射棘球絳蟲AQPs cRNA卵母細(xì)胞的透水系數(shù)檢測(cè) 如圖2所示，注射棘球絳蟲AQPs cRNA的卵母細(xì)胞與注射DEPC水的卵母細(xì)胞的體積變化率(V/V0)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.143,P>0.05)。注射EgAQP4、EgAQP9、EmAQP4和EmAQP9 cRNA的卵母細(xì)胞透水系數(shù)分別為3.60±0.42×10-8cm/s、3.29±0.33×10-8cm/s、3.57±0.43×10-8cm/s和3.53±0.32×10-8cm/s (n=20)，對(duì)照組注射DEPC水的卵母細(xì)胞的透水系數(shù)為(3.62±0.52×10-8cm/s，n=20),各組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.416，P>0.05)。

其中V為任一時(shí)刻體積、V0為初始體積。圖2 注射了EgAQP4、EgAQP9、EmAQP4、EmAQP9基因cRNA及DEPC水的非洲爪蟾卵母細(xì)胞體積變化率(V/V0)Fig.2 Swelling rate of X. laevis oocytes (V/V0) injected with cRNA encoding EgAQP4, EgAQP9, EmAQP4, EmAQP9 or DEPC water control

圖3 注射了EgAQP4、EgAQP9、EmAQP4、EmAQP9基因cRNA的卵母細(xì)胞透水系數(shù) (Pf)值Fig.3 Osmotic water permeability coefficient (Pf) of oocytes injected with cRNA encoding EgAQP4, EgAQP9, EmAQP4, EmAQP9 or DEPC water control

2.3跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及多序列比對(duì) 水通道蛋白的6個(gè)跨膜螺旋參與構(gòu)成通道管，跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，EgAQP4和EmAQP4具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N和C末端均位于細(xì)胞質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)(圖4A)，而EgAQP9和EmAQP9具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N末端位于胞外側(cè)，C末端位于胞質(zhì)側(cè)(圖4B)。

A：EgAQP4和EmAQP4具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；B：EgAQP9和EmAQP9具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。圖4 細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲AQPs跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Prediction of transmembrane regions of AQPs of E. granulosus and E. multilocularis

人AQP1和AQP9具有水通道蛋白家族共同的結(jié)構(gòu)特征，即氨基酸序列中含有2個(gè)高度保守的NPA基序，二級(jí)結(jié)構(gòu)含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，蛋白的N末端和C末端都在胞質(zhì)側(cè)。NPA基序被認(rèn)為是水通道蛋白通透水分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，棘球絳蟲AQPs與人AQPs的多序列比對(duì)結(jié)果表明，NPA基序在棘球絳蟲AQPs中并不保守，EgAQP4和EmAQP4的NPA基序分別為NPM和NPT，而EgAQP9和EmAQP9具有兩個(gè)保守的NPA基序(圖5)。

各蛋白登錄號(hào)如下：CDS35949.1(EmAQP9)、CDI97472.1(EmAQP4)、CDS21752.1(EgAQP4)、CDS22736.1(EgAQP9)、AAX24129.1(人AQP1)、BAA24864.1(人AQP9)；NPA基序用方框標(biāo)示。圖5 棘球絳蟲AQPs與人AQPs多序列比對(duì)結(jié)果Fig.5 Multiple sequence alignment of AQPs of Echinococcus and human AQPs

3 討 論

包蟲病是我國(guó)需要重點(diǎn)防治的寄生蟲病之一[18]，在新疆、青海、甘肅、寧夏等省區(qū)同時(shí)有CE和AE兩種類型的包蟲病，嚴(yán)重威脅這些省區(qū)群眾的健康和生命安全。盡管我國(guó)開展了包蟲病防治活動(dòng)，也取得了一定的成效，但該病仍沒有得到有效控制[19]，因此尋找有效的防治措施對(duì)預(yù)防、控制和治療該病具有重要的意義。目前，通過基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，尋找寄生蟲發(fā)生發(fā)育過程中特異性的藥物治療靶點(diǎn)，是包蟲病研究的熱點(diǎn)[20]。有關(guān)棘球蚴病及棘球蚴的生物學(xué)特性研究已有不少，但棘球蚴生長(zhǎng)過程中囊液的來源及生成機(jī)制一直是個(gè)謎。通過對(duì)棘球蚴囊壁生發(fā)層細(xì)胞膜上水通道研究不但有助于更科學(xué)地理解棘球蚴囊液的形成過程，更可為棘球蚴病的藥物治療提供新的靶點(diǎn)。

由于細(xì)粒棘球蚴在小鼠體內(nèi)發(fā)育為不育囊[21]，而多房棘球蚴囊泡內(nèi)原頭蚴的數(shù)目極少，因此本研究所提取的囊泡mRNA實(shí)際上就是囊壁生發(fā)層細(xì)胞的mRNA。本研究以囊壁生發(fā)層細(xì)胞mRNA為模板，對(duì)細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴共13個(gè)AQPs基因進(jìn)行RT-PCR，成功克隆了EgAQP4、EgAQP9、EmAQP4和EmAQP9四個(gè)基因。將這4個(gè)AQPs基因的測(cè)序結(jié)果與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)里的序列進(jìn)行Blastx比對(duì)，結(jié)果表明擴(kuò)增得到的EgAQP4、EgAQP9、EmAQP4和EmAQP9序列與NCBI中相應(yīng)序列的一致性為100%。

由于非洲爪蟾卵母細(xì)胞具有細(xì)胞體積大，mRNA翻譯能力強(qiáng)且質(zhì)膜水通透性低等特點(diǎn)，使該系統(tǒng)成為目前檢測(cè)寄生蟲水通道蛋白功能最常用的檢測(cè)系統(tǒng)。利用該檢測(cè)系統(tǒng)證實(shí)了多種寄生蟲AQP的水通道蛋白功能，例如后睪吸蟲[22]、隱桿線蟲[23]、大片形吸蟲[24]、利什曼原蟲[25]以及惡性瘧原蟲[26]。利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞驗(yàn)證水通道蛋白功能的過程如下：將水通道蛋白的cRNA注射入非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，在等滲溶液中培養(yǎng)2～3 d，讓蛋白質(zhì)得以合成。再將細(xì)胞轉(zhuǎn)入低滲溶液內(nèi)，在顯微照相儀器下觀察記錄細(xì)胞體積的變化。通過與對(duì)照卵母細(xì)胞比較透水系數(shù)和發(fā)生破裂的時(shí)間，推測(cè)水通道蛋白功能活性。本研究以非洲爪蟾卵母細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)將EgAQP4、EgAQP9、EmAQP4和EmAQP9的cRNA注射入非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，以驗(yàn)證它們的水通道功能。本研究的試驗(yàn)結(jié)果表明注射棘球絳蟲AQPs cRNA的卵母細(xì)胞與注射DEPC水的卵母細(xì)胞體積變化率及透水系數(shù)差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)典的水通道蛋白具有6個(gè)跨膜螺旋和2個(gè)保守的NPA基序，N和C末端位于細(xì)胞質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)。水通道蛋白的6個(gè)跨膜螺旋參與構(gòu)成通道管，跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，EgAQP4和EmAQP4雖然N和C末端均位于胞質(zhì)側(cè)，但跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目為四個(gè)；EgAQP9和EmAQP9 N末端位于胞外側(cè)、C末端位于胞質(zhì)側(cè)，跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目為五個(gè)。NPA基序被認(rèn)為是水通道蛋白通透水分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，棘球絳蟲AQPs與人AQPs的多序列比對(duì)結(jié)果表明，NPA基序在棘球絳蟲AQPs中并不保守，EgAQP4和EmAQP4的NPA基序分別為NPM和NPT，而EgAQP9和EmAQP9具有兩個(gè)保守的NPA基序。結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及多序列比對(duì)結(jié)果，本研究所擴(kuò)增到的四個(gè)AQPs均不具有6個(gè)跨膜螺旋，而且EgAQP4和EmAQP4雖然N和C末端均位于胞質(zhì)側(cè)，但NPA基序被替換為NPM和NPT；EgAQP9和EmAQP9雖然具有兩個(gè)保守的NPA基序，但N末端位于胞外側(cè)、C末端位于胞質(zhì)側(cè)，棘球蚴AQPs的這些結(jié)構(gòu)差異可能是其在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中未表現(xiàn)水通道蛋白的原因。

基因克隆及卵母細(xì)胞功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管棘球絳蟲基因組中存在編碼AQPs的基因，但這些AQPs基因不具有水通道功能，這可能正與棘球蚴的囊液形成機(jī)制相關(guān)。棘球絳蟲囊液形成的過程可能是囊壁部分生發(fā)層細(xì)胞壞死后發(fā)生溶解液化，由此形成的水份不能通過生發(fā)層細(xì)胞膜上的AQPs進(jìn)入生發(fā)層細(xì)胞而致使生發(fā)層細(xì)胞腫脹壞死，囊泡能在中間宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活、長(zhǎng)大。單房棘球蚴常為單個(gè)囊，體積較大，囊壁生發(fā)層面積大，生發(fā)層細(xì)胞數(shù)量多，生發(fā)層細(xì)胞壞死液化后形成的水較多；而多房棘球蚴由無數(shù)個(gè)小囊泡相互連接聚集而成，囊泡體積小，單個(gè)囊泡生發(fā)層面積小，生發(fā)層細(xì)胞數(shù)量少，生發(fā)層細(xì)胞壞死液化后形成的水較少。這可能是單房棘球蚴的體積比泡球蚴大，囊液比泡球蚴多的原因之一。

綜上所述，盡管細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲基因組中總共有13個(gè)編碼AQPs的基因，但本研究通過RT-PCR僅成功克隆了EgAQP4、EgAQP9、EmAQP4和EmAQP9四個(gè)基因，這四個(gè)AQPs基因在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中不具有水通道的功能?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及多序列比對(duì)結(jié)果表明，與經(jīng)典的水通道蛋白相比，EgAQP4和EmAQP4雖然N和C末端均位于胞質(zhì)側(cè)，但跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目為四個(gè)，NPA基序替換為NPM和NPT；而EgAQP9和EmAQP9雖然具有兩個(gè)保守的NPA基序，但跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目為五個(gè)，N末端位于胞外側(cè)、C末端位于胞質(zhì)側(cè)。本研究所擴(kuò)增到的四個(gè)AQPs結(jié)構(gòu)與經(jīng)典水通道蛋白結(jié)構(gòu)有所差異，可能是其在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中未表現(xiàn)水通道蛋白的原因。該結(jié)果可能正好說明了囊內(nèi)的水份不能通過AQPs進(jìn)入生發(fā)層細(xì)胞而致使細(xì)胞腫脹壞死，囊液中的水份亦不能通過AQP的通道作用從生發(fā)層細(xì)胞流至囊外，囊液累積致使包囊或囊泡體積長(zhǎng)大。本研究結(jié)果為科學(xué)的理解棘球蚴囊液的形成過程提供了理論依據(jù)，如果能尋找到有效激活A(yù)QPs基因的藥物則可以為篩選治療棘球蚴病藥物靶點(diǎn)提供新思路。

(感謝清華大學(xué)的陶慶華教授和朱薛辰博士，在他們提供的實(shí)驗(yàn)室及技術(shù)指導(dǎo)下本研究的爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)才得以順利完成。感謝成都醫(yī)學(xué)院王昕教授提供感染多房棘球絳蟲的大鼠。感謝新疆醫(yī)科大學(xué)的呂國(guó)棟教授對(duì)本實(shí)驗(yàn)提供的幫助。)

[1] Wang Q, Huang Y, Huang L, et al. Review of risk factors for human echinococcosis prevalence on the Qinghai-Tibet Plateau, China: a prospective for control options[J]. Infect Dis Poverty, 2014, 3(1): 3. DOI: 10.1186/2049-9957-3-3

[2] Sezgin O, Altintas E, Saritas U, et al. Hepatic alveolar echinococcosis: clinical and radiologic features and endoscopic management[J]. J Clin Gastroenterol, 2005, 39(2): 160-167. DOI:10.1097/01.mcg.0000150242.72499.22

[3] Hemphill A, Mueller J. Alveolar and cystic echinococcosis: towards novel chemotherapeutical treatment options[J]. J Helminthol, 2009, 83(2): 99-111. DOI: 10.1017/S0022149-X0928936X

[4] Kern P. Clinical features and treatment of alveolar echinococcosis[J]. Curr Opin Infect Dis, 2010, 23(5): 505-512. DOI: 10.1097/QCO.0b013e32833d7516

[5] 張宏偉, 彭心宇. 中西藥聯(lián)合阿苯達(dá)唑治療棘球蚴病研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志, 2009, 4(9): 705-708.

[6] Reuter S, Jensen B, Buttenschoen K, et al. Benzimidazoles in the treatment of alveolar echinococcosis: a comparative study and review of the literature[J]. J Antimicrob Chemother, 2000, 46(3): 451-456. DOI: 10.1093/jac/46.3.451

[7] 余森海. 棘球蚴病防治研究的國(guó)際現(xiàn)狀和對(duì)我們的啟示[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2008, 26(4): 241-244.

[8] 隋海心, 任罡. 水分子通道蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2004, 16(2): 145-152.

[9] Abascal F, Irisarri L, Zardoya R. Diversity and evolution of membrane intrinsic proteins[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840(5): 1468-1481. DOI: 10.1016/j.bbagen.2013.12.001

[10] Wang Y, Tajkhorshid E. Molecular mechanisms of conduction and selectivity in aquaporin water channels[J]. J Nutr, 2007, 137(6 suppl 1): 1509-1515

[11] Ishibashi K. Aquaporin subfamily with unusual NPA boxes[J]. Biochim Biophys Acta, 2006, 1758(8): 989-993. DOI: 10.1016/j.bbamem.2006.02.024

[12] Gomes D, Agasse A, Thiebaud P, et al. Aquaporins are multifunctional water and solute transporters highly divergent in living organisms[J]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1788(6): 1213-1228. DOI: 10.1016/j.bbamem.2009.03.009

[13] Beitz E. Aquaporin water and solute channels from malaria parasites and other pathogenic protozoa[J]. Chem Med Chem, 2006, 1(6): 587-592. DOI: 10.1002.cmdc.200500105

[14] Song J, Mak E, Wu BH, et al. Parasite aquaporins: Current developments in drug facilitation and resistance[J]. Biochim Biophysica Acta, 2014, 1840(5): 1566-1573. DOI: 10.1016/j.bbagen.2013.10.014

[15] Reisin IL, Pavisicdefal C. Membrane permeability of secondary hydatid cysts ofEchinococcusgranulosus. Determination of the water diffusional and osmotic permeability cofficients through a syncytial membrane[J]. Mol Biochem Parasitol, 1984, 12(1):101-116. DOI: 10.1016/0166-6851(84)90048-3

[16] Zheng HJ, Zhang WB, Zhang L, et al. The genome of the hydatid tapewormEchinococcusgranulosus[J]. Nat Genet, 2013, 45(10): 1168-1175. DOI: 10.1038/ng.2757

[17] Zhang RB, Verkman AS. Water and urea permeability properties ofXenopusoocytes: expression of mRNA from toad urinary bladder[J]. Am J Physiol, 1991, 260 (1): 26-34. DOI: 10.1152/ajpcell.1991.260.1.C26

[18] Torgerson PR, Keller K, Magnotta M, et al. The global burden of alveolar echinococcosis[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2010, 4(6): e722-e722. DOI: 10.1371/journal.pntd.0000722

[19] 葉爾江·蘇里唐, 江莉, 柴君杰. 我國(guó)棘球蚴病防治研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病學(xué)雜志, 2000, 18 (13): 179-181.

[20] 溫浩, 吐爾干艾力·阿吉, 邵英梅, 等. 棘球蚴病防治成就及面臨的挑戰(zhàn)[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2015, 33 (6): 466-471.

[21] 李紅衛(wèi), 袁芳, 李燕兵, 等. 昆明種小鼠棘球蚴病感染動(dòng)物模型的建立[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 33(5): 411-413.

[22] Geadkaew A, Bulow JV, Beitz E, et al. Bi-functionality ofOpisthorchisviverriniaquaporins[J]. Biochimie, 2015, 108: 149-159. DOI: 10.1016/j.biochi.2014.11.013

[23] Huang CG, Lamitina T, Agre P, et al. Functional analysis of the aquaporin gene family inCaenorhabditiselegans[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 292 (5): C1867-C1873. DOI: 10.1152/ajpcell.00514.2006

[24] Geadkaew A, Von BJ, Beitz E, et al. Functional analysis of novel aquaporins fromFasciolagigantica[J]. Mol Biochem Parasitol, 2011, 175(2): 144-153. DOI: 10.1016/j.molbiopara.2010.10.010

[25] Figarella K, Uzcategui NL, Zhou Y, et al. Biochemical characterization ofLeishmaniamajor aquaglyceroporin LmAQP1: possible role in volume regulation and osmotaxis[J]. Mol Microbiol, 2007, 65(4): 1006-1017. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2007.05845x

[26] Hedfalk K, Pettersson N, Oberg f, et al. Production, characterization and crystallization of thePlasmodiumfalciparumaquaporin[J]. Protein Expr Purif, 2008, 59(1): 69-78. DOI: 10.1016/j.pep.2008.01.004