曾清 陸海頌 程緯民 何艾 鄧德君 賴春鳳

[摘要] 目的 觀察參萸補(bǔ)血方對(duì)再生障礙性貧血（AA）模型小鼠Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-17及IL-23表達(dá)水平的影響，探討其治療AA的效果。 方法 選取清潔級(jí)BALB/c小鼠80只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、參萸補(bǔ)血方組、強(qiáng)的松（陽(yáng)性對(duì)照）組。以60CO-γ射線照射加腹腔注射環(huán)磷酰胺（CY）加氯霉素（CH）復(fù)合方法建立AA小鼠模型。造模成功后給藥干預(yù)，連續(xù)4周后觀察各組小鼠外周血象改變及各組小鼠Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-6、IL-17及IL-23表達(dá)水平的變化，光鏡下觀察骨髓增生程度。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血象和骨髓增生明顯降低，Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-6、IL-23和IL-17表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型組比較，參萸補(bǔ)血方組小鼠外周血像明顯升高，Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-6、IL-23和IL-17表達(dá)水平下降，骨髓增生明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 參萸補(bǔ)血方可改善AA模型小鼠的骨髓造血功能，可能與其抑制T細(xì)胞免疫功能相關(guān)的IL-6、IL-17及IL-23表達(dá)水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 再生障礙性貧血；參萸補(bǔ)血方；Th17細(xì)胞；白介素17；白介素6

[中圖分類號(hào)] R556.53 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）04（c）-0013-04

Effects of Shenyu Buxue Decotion on the Th17 cells and expression of its related IL-6， IL-17 and IL-23 expression in mice with aplastic anemia

ZENG Qing1 LU Haisong1 CHENG Weimin1 HE Ai1 DENG Dejun2 LAI Chunfeng3

1.Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530023， China； 2.Graduate School， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 500001， China； 3.Department of Oncology， Yullin Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Yulin 537000， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Shenyu Buxue Decotion on Th17 cells and the expression of IL-6， IL-17 and IL-23 in aplastic anemia （AA） model mice， and to explore its curative effect for AA. Methods Eighty clean-class BALB/c mice were divided into control group， model group， Shenyu Buxue Decotion group and Prednisone （positive control） group by random number table. The AA models were established by irradiated with 60CO-γ ray together with intraperitoneal injection of cyclophosphamide （CY） and chloramphenicol （CH）. After AA models were successfully established， mice were given to medicines for 4 weeks. The changes of mice peripheral hemogram， Th17 cells and the expression levels of IL-6， IL-17 and IL-23， and the degree of bone marrow hyperplasia under light microscope were observed. Results Compared with the control group， the peripheral hemogram and bone marrow hyperplasia were decreased， while Th17 cells and expression of IL-6， IL-23 and IL-17 were increased in the model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared with the model group， in the Shenyu Buxue Decotion group， the peripheral hemogram were increased， Th17 cells and the expression of IL-6， IL-23 and IL-17 were decreased， and bone marrow hyperplasia was improved， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Shenyu Buxue Decotion can improve the bone marrow hematopoietic function of AA mice， which may due to the inhibition of the T cell immune function related IL-6， IL-17 and IL-23.

[Key words] Aplastic anemia； Shenyu Buxue Decotion； Th17 cell； IL-17； IL-6

參萸補(bǔ)血方由黨參、山萸肉、茯苓、仙靈脾、白術(shù)、杜仲等組成，具有溫補(bǔ)脾腎的功效，臨床用于再生障礙性貧血（AA）治療，效果顯著，觀察發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)是其主要療效機(jī)制之一。本研究通過(guò)觀察參萸補(bǔ)血方對(duì)AA小鼠骨髓增殖及T細(xì)胞免疫功能及其相關(guān)的白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-17及IL-23表達(dá)水平的影響，探討其治療AA的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠80只，雄性，SPF級(jí)，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2 主要藥品及試劑 環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CY），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：16092225。氯霉素（Chloramphenicol，CH），陜西省西安婦幼制藥廠，批號(hào)：912525。醋酸潑尼松片，天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)：1607021。IL-6試劑盒，cusalio，編號(hào)：CSB-E04639m。IL-23試劑盒，cusalio，編號(hào)：CSB-E08463m。IL-17試劑盒，欣博盛生物科技有限公司，編號(hào)：EMC008CH。中藥材由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）藥劑科提供。

1.1.3 儀器 美國(guó)VARIAN電子直線加速器，邁瑞B(yǎng)C-1800plus全自動(dòng)血液分析儀，德國(guó)EPPENDORF 5418產(chǎn)離心機(jī)，美國(guó)Thermo酶標(biāo)儀，Olympus BEION V4.2型顯微鏡等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AA小鼠模型的建立 AA小鼠模型建立：第1天BalB/C小鼠1次全身3 Gy 60CO-γ射線均勻照射，能量8 Me-V，單次劑量300 cGy，源皮距100 cm，照射時(shí)間1 min[1-2]。照射后第4～6天各行1次腹腔注射（ip）CY 50 mg/kg及CH 62.5 mg/kg[2-3]。自由飲水。至第2周末，形成AA模型。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 80只清潔級(jí)雄性BalB/C小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、參萸補(bǔ)血方組、強(qiáng)的松（陽(yáng)性對(duì)照）組、模型組4組。正常對(duì)照組不造模，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲用蒸餾水；根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，人鼠折算公式計(jì)算，參萸補(bǔ)血方組小鼠以30 mg/（kg·d）的藥物濃度灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組以藥物濃度為9.1 mg/（kg·d）的潑尼松片灌胃；模型組以10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，至第4周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 動(dòng)物一般情況 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天觀察并記錄各組小鼠的飲食、活動(dòng)、毛色、體重和死亡情況。

1.3.2 標(biāo)本處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死各組小鼠。各組小鼠通過(guò)摘取眼球、眼眶取血備用，隨后頸椎脫臼處死，分離出雙側(cè)股骨。剪截取右側(cè)股骨中段7 mm處，用空氣快速吹打出骨髓液，制成骨髓涂片，瑞氏-吉姆薩染色，送我院檢驗(yàn)科觀察骨髓象。

1.3.3 檢測(cè)方法 光鏡下評(píng)估骨髓增生程度及骨髓非造血細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞等）百分率變化。瑞氏染色骨髓增生程度判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：增生極度減低（-），紅細(xì)胞與有核細(xì)胞之比為100～300∶1；增生減低（+），紅細(xì)胞與有核細(xì)胞之比為35～70∶1；增生活躍（++），紅細(xì)胞與有核細(xì)胞之比為16～32∶1；增生明顯活躍（+++），紅細(xì)胞與有核細(xì)胞之比為5～12∶1；增生極度活躍（++++），紅細(xì)胞與有核細(xì)胞之比為0.5～2.0∶1。

外周血象送我院檢驗(yàn)科進(jìn)行外周血象計(jì)數(shù)；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMCs的Th-17/CD4+細(xì)胞比例；用ELISA檢測(cè)血清IL-6、IL-23、IL-17的水平，按試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常組小鼠一般情況良好，毛被光澤，行動(dòng)靈活，食量及大便正常。模型組小鼠形體消瘦，精神不振，行動(dòng)遲緩，行走不穩(wěn)，食量明顯減少，毛色無(wú)光澤易脫落；經(jīng)治療后，參萸補(bǔ)血方組和強(qiáng)的松組小鼠活動(dòng)正常，一般情況較模型組明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 外周血象

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血中白細(xì)胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）數(shù)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型組比較，參萸補(bǔ)血方組與強(qiáng)的松組小鼠外周血中WBC、HGB和PLT數(shù)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 骨髓細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

2.3.1 外觀取材涂片觀察 肉眼觀察：正常對(duì)照組小鼠骨髓涂片涂膜面厚薄適中，無(wú)脂肪珠，可見骨髓小粒；模型組小鼠骨髓涂片涂膜面較薄，可見脂肪珠，無(wú)明顯骨髓小粒。參萸補(bǔ)血方組和強(qiáng)的松組之間骨髓涂片肉眼觀察差別不明顯，涂膜面厚薄適中，無(wú)脂肪珠，骨髓小粒介于模型組與正常對(duì)照組之間。

2.3.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析 鏡下觀察：正常對(duì)照組小鼠骨髓全片小粒明顯，無(wú)油滴，骨髓增生活躍，有核細(xì)胞密布，各系比例大致正常，成熟紅細(xì)胞形態(tài)正常，巨核細(xì)胞多見，血小板多見，成簇分布。模型組小鼠部分骨髓涂片出現(xiàn)油滴，骨髓全面衰竭呈增生障礙，造血細(xì)胞減少，非造血細(xì)胞增多，成熟紅細(xì)胞大小一致，無(wú)明顯淡染區(qū)，巨核細(xì)胞缺如，血小板減少。參萸補(bǔ)血方組與強(qiáng)的松組小鼠骨髓衰竭程度明顯減輕，油滴較模型組明顯減少，僅見少量脂肪空泡，部分骨髓片可見散在造血灶，偶見巨核細(xì)胞，血小板散在。見圖1。