周宏 李文平 裴斐 吳剛

[摘要] 目的 探討ANO1在頭頸部鱗癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系。 方法 運(yùn)用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析ANO1 mRNA在頭頸部鱗癌組織與正常黏膜組織表達(dá)的差異性及與預(yù)后的關(guān)系。收集2017年2～10月在復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院接受手術(shù)的喉癌患者的標(biāo)本，采用RT-PCR檢測ANO1 mRNA在喉鱗癌組織（26例）與正常黏膜組織（26例）中的表達(dá)情況。檢索cBioPortal數(shù)據(jù)庫，分析ANO1 mRNA在頭頸部鱗癌中的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。 結(jié)果 在多種頭頸部鱗癌組織中ANO1 mRNA表達(dá)顯著高于正常黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。運(yùn)用Rickman數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)ANO1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者的5年總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ﹥ 0.05），而從cBioPortal數(shù)據(jù)庫（TCGA，Provisional）分析發(fā)現(xiàn)ANO1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)的總生存率、無疾病/進(jìn)展生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 ANO1在頭頸部鱗癌組織中的表達(dá)高于正常黏膜組織，ANO1高表達(dá)的患者，生存期較短，預(yù)后較差。

[關(guān)鍵詞] ANO1；頭頸部鱗狀細(xì)胞癌；預(yù)后；數(shù)據(jù)庫

[中圖分類號] R739.91 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（c）-0017-04

Expression of ANO1 and its correlation with the prognosis of head and neck squamous cell carcinoma

ZHOU Hong LI Wenping PEI Fei WU Gang

Department of Otorhinolarygology Head and Neck Surgery， Fudan University Pudong Medical Center， Shanghai 201399， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of ANO1 in head and neck squamous cell carcinoma （HNSCC） and to determine the prognostic value of ANO1 for HNSCC patients. Methods The differences of ANO1 mRNA expressions in HNSCC and normal mucosa tissues were analyzed based on Oncomine database. The specimens of patients undergoing surgery with laryngeal cancer in Fudan University Pudong Medical Center from February to October 2017 were collected. ANO1 mRNA expressions in laryngeal cancer （26 cases） and normal mucosa tissues （26 cases） were determined using RT-PCR. The relationship between ANO1 mRNA expression and prognosis of HNSCC patients was analyzed using Oncomine and cBioPortal database. Results The mRNA expression of ANO1 was significantly higher in multipe HNSCC tissues than normal mucosa tissues （P < 0.05）. Using Rickman statistics， there was no significant difference in 5-year overall survival （OS） between ANO1 mRNA high expression and low expression patients （P ﹥ 0.05）. However， there were significant differences in OS and disease/progression-free survival （DFS/PFS） between ANO1 mRNA high expression and low expression patients through searching cBioPortal database （TCGA， Provisional） （P < 0.05）. Conclusion The expression of ANO1 is elevated in HNSCC tissues. Patients with high expression of ANO1 had lower survival than those with low expression.

[Key words] ANO1； Head and neck squamous cell carcinoma； Prognosis； Database、

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是世界第6大常見的好發(fā)腫瘤[1]，從解剖位置上包括口咽癌、下咽癌、鼻咽癌、口腔癌和喉癌。據(jù)統(tǒng)計，2017年在美國有超過60 000的HNSCC新患者被發(fā)現(xiàn)，并且大約有13 000患者死于該疾病[2]。研究證實，HNSCC的發(fā)生與煙草、酒精及人類乳頭狀病毒感染密切相關(guān)[3]。目前，早期HNSCC的治療主要以手術(shù)和單獨(dú)放療或者同步放化療為主，晚期HNSCC以多學(xué)科綜合治療為主。盡管治療手段的多樣性，但患者的生存率還是比較低。越來越多的研究表明，生物分子物的檢測可以評估頭頸部腫瘤的預(yù)后。

ANO1又稱為跨膜蛋白16A，是鈣離子激活氯離子通道蛋白家族成員之一[4]。ANO1在體內(nèi)承擔(dān)多種生理功能：離子轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)其他離子通道、平滑肌收縮、神經(jīng)元興奮性控制、細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)等[5]。同時，ANO1在多種惡性腫瘤中的作用也得到較大的關(guān)注。在惡性腫瘤中由于11q13染色體擴(kuò)增而呈高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，且與預(yù)后相關(guān)[6]。因此，本研究進(jìn)一步探討ANO1在HNSCC中的表達(dá)情況及與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

Oncomine數(shù)據(jù)庫（www.oncomine.org）是一個癌基因芯片數(shù)據(jù)庫，主要提供腫瘤基因的相關(guān)信息。在本研究中設(shè)定篩選條件：①Gene：ANO1；②Cancer Type：Head and Neck Cancer；③Data Type：mRNA；④Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysia；⑤Clincal Outcome：Survival Status at 5 Years。通過選擇ANO1在癌組織與正常黏膜組織之間表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系、P值來顯示結(jié)果，分析在ANO1 mRNA水平上HNSCC與正常黏膜表達(dá)的差異性及與預(yù)后的關(guān)系。

1.2 從cBioPortal 數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

cBioPortal數(shù)據(jù)庫（www.cbioportal.org）整合了癌癥基因圖譜（TCGA）和國際癌癥基因組聯(lián)盟（ICGC）等多個數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，主要提供癌癥基因組數(shù)據(jù)、綜合分析基因組數(shù)據(jù)和臨床資料等。檢索cBioPortal數(shù)據(jù)庫，依次勾選Head and Neck；Head and Neck Squamous cell carcinoma（TCGA，Provisional）；mRNA Expression z-Scores（RNA Seq V2 RSEM），輸入基因ANO1，獲得與ANO1基因相關(guān)的數(shù)據(jù)，分析ANO1 mRNA在HNSCC中的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。

1.3 RT-PCR方法檢測ANO1 mRNA在喉鱗癌中的表達(dá)情況

病例標(biāo)本來源于2017年2～10月在復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院接受手術(shù)的26例喉癌患者，其中男24例，女2例；年齡42～75歲，平均63.5歲；病例分期按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例。術(shù)前未行放化療，術(shù)后組織病理診斷均為喉鱗狀細(xì)胞癌，為原發(fā)腫瘤。術(shù)中快速將配對的癌組織和癌旁正常黏膜組織標(biāo)本裝在2 mL凍存管中，標(biāo)記后快速放進(jìn)液氮罐，在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol法提取喉癌組織及正常黏膜組織中的總RNA。用Qiagen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，在ABI ViiA7實時定量PCR儀（美國ABI公司）中進(jìn)行后續(xù)定量PCR反應(yīng)。引物購置生工生物工程（上海）股份有限公司，ANO1基因及內(nèi)參的引物序列如下：ANO1引物：上游5′-CTCCTGGACGAGGTGTATCG-3′，下游5′-GAACGCCACGTAAAAGACGG-3′。GAPDH引物：上游5′-TG？鄄CCCTCAACGACCACTTT-3′，下游5′-GGTCCAGGGG？鄄TCTTACTCCTT-3′。反應(yīng)結(jié)束后，用溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，以2-△△Ct法分析癌組織中ANO1的表達(dá)相對于正常黏膜組織中的變化倍數(shù)，以此表示目的基因ANO1的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANO1在HNSCC中的表達(dá)特征

通過檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫，獲得了在HNSCC中ANO1 mRNA表達(dá)顯著高于正常黏膜組織。在Ye數(shù)據(jù)集中[7]，ANO1 mRNA表達(dá)在舌鱗癌（26例）較正常舌黏膜（12例）升高3.824倍（P=4.49），見圖1。在Toruner數(shù)據(jù)集中[8]，ANO1 mRNA表達(dá)在口腔鱗癌（16例）較正?？谇火つぃ?例）升高1.712倍（P=0.027），見圖2。通過RT-PCR檢測，ANO1 mRNA表達(dá)在喉鱗癌（26例）較正常喉黏膜（26例）表達(dá)顯著上調(diào)，倍數(shù)變化為2倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001），見圖3。

2.2 ANO1表達(dá)與HNSCC患者的相關(guān)性

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索及臨床標(biāo)本的實驗，證實ANO1 mRNA在不同部位的HNSCC中表達(dá)較正常黏膜組織顯著增高，同時，在Oncomine數(shù)據(jù)庫Rickman等[9]的研究中，提取ANO1與HNSCC預(yù)后相關(guān)的數(shù)據(jù)，得出Kaplan-Meier生存曲線，ANO1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者的5年OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0699）。見圖4。

通過檢索cBioPortal數(shù)據(jù)庫（TCGA，Provisional），收集530例樣本ANO1基因表達(dá)數(shù)據(jù)，按照表達(dá)高低分為高表達(dá)組（141例）和低表達(dá)組（389例），分析ANO1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性，得出Kaplan-Meier生存曲線。結(jié)果顯示，ANO1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者的OS、DFS/PFS差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖5、6。

3 討論

HNSCC具有高發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，61%的HNSCC患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)，高達(dá)26%的患者發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]。盡管有多種治療方法：手術(shù)、放化療、靶向治療、免疫治療等，但HNSCC患者5年OS仍不高，為40%，復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成為預(yù)后差和致死的主要原因[11]。研究表明，HNSCC的發(fā)生發(fā)展與許多重要的癌基因發(fā)生突變及表達(dá)異常密切相關(guān)[12]。因此，尋找一種分子標(biāo)志物對評估HNSCC患者預(yù)后有非常重要的作用。

ANO1基因定位于11q13.3，編碼含8個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白[13]。ANO1在維持生理功能上起著重要的作用，其陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能已在小鼠心肌細(xì)胞的實驗中證實[14]。同時，ANO1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。ANO1在乳腺癌[15]、食管鱗癌[16]、前列腺癌[17]、肺癌[18]等腫瘤中高表達(dá)，且與患者的淋巴轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[19]，ANO1通過其氯離子通道蛋白的活性發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，故被認(rèn)為是極好的腫瘤分子標(biāo)志物。

本研究通過挖掘Oncomine數(shù)據(jù)庫及對臨床標(biāo)本的檢測分析了ANO1分別在舌鱗癌、口腔癌、喉鱗癌和正常黏膜組織的差異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ANO1在HNSCC中的表達(dá)水平顯著高于正常黏膜組織。同時，通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析了ANO1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ANO1高低表達(dá)與預(yù)后無顯著相關(guān)性，推測研究納入的研究對象較少，而出現(xiàn)無顯著相關(guān)性。而通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)ANO1高低表達(dá)與患者預(yù)后顯著相關(guān)，ANO1高表達(dá)患者，預(yù)后較差。因此在HNSCC中，ANO1通過一定的機(jī)制影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究報道了ANO1在HNSCC中的表達(dá)顯著高于正常黏膜組織，ANO1高表達(dá)的患者生存期較短，預(yù)后較差。因此有必要進(jìn)一步研究其作用于腫瘤的機(jī)制，對改善患者預(yù)后的研究具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2018-03-10 本文編輯：任 念）