李書(shū)壇 黃純蘭

[摘要] 目的 研究BMP-2聯(lián)合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）造血干細(xì)胞（HSC）體外增殖的影響。 方法 培養(yǎng)MSC至第三代，磁珠分選儀分選HSC，并用流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSC與HSC。將獲得的MSC與HSC利用Transwell非接觸共培養(yǎng)，100 ng/mL的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）干預(yù)，即實(shí)驗(yàn)分四組：HSC組、HSC+BMP2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP2組。培養(yǎng)3 d后比較不同培養(yǎng)條件下HSC計(jì)數(shù)、RNA濃度的不同，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及免疫熒光方法檢測(cè)HSC的Ki67的mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 HSC的計(jì)數(shù)、總RNA含量、Ki67的表達(dá)在HSC+BMP2組高于HSC組、HSC+MSC組高于HSC組、HSC+MSC+BMP2組高于HSC+MSC組（P < 0.05）。 結(jié)論 MSC協(xié)同BMP-2蛋白可促進(jìn)HSC的增殖。

[關(guān)鍵詞] 造血干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；BMP-2；增殖

[中圖分類(lèi)號(hào)] R331.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）04（c）-0004-05

The effect of bone marrow mesenchymal stem cell synergistic BMP-2 in the proliferation of hematopoietic stem cell

LI Shutan HUANG Chunlan

Department of Hematology， the Affiliated Hospital of Southwestern Medical University， Sichuan Province， Luzhou 646000， China

[Abstract] Objective To explore the proliferation effect of bone morphogenetic protein （BMP）-2 on hematopoietic stem cell （HSC） cocultured with mesenchymal stem cell （MSC）. Methods MSCs were expanded to the third passage （P3） in the plastic dish； CD34+ cells were sorted by MACS Miltenyi Biotec. MSCs（P3） and HSCs were identified by FCM separately， and then MSC （P3） and HSC were co-cultured in the Transwell interfered with BMP-2 protein， four groups in the study： HSC group， HSC+BMP2 group， HSC+MSC group， HSC+MSC+BMP2 group. Cells were collected after 3 d to test HSC proliferation using the following methods：counting of the number， detecting of the total RNA， the mRNA and protein expression of Ki67 were detected by fluorescence qRT-PCR and immunofluorescence methods. Results The number of HSC， totel RNA， Ki67 expression of the HSC+BMP2 group was higher than HSC group， HSC+MSC group was higher than HSC group， HSC+MSC+BMP2 group was higher than HSC+MSC group （P < 0.05）. Conclusion MSCs synergistic with BMP-2 can enhance MSC proliferation effect on HSC.

[Key words] Hematopoietic stem cell； Mesenchymal stem cell； BMP-2； Proliferation

造血干細(xì)胞（hematopoietie stem cells，HSC）自我更新及多向分化等生理過(guò)程都離不開(kāi)其生存的微環(huán)境增殖。骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其前體間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）以及它分泌的黏附分子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，它們共同構(gòu)成的微環(huán)境即微龕“niche”調(diào)控著HSC的增殖等。從微環(huán)境的角度研究MSC對(duì)HSC的增殖作用及其機(jī)制是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[1-3]。BMP-2蛋白是多功能蛋白，可直接參與造血的調(diào)控，對(duì)造血表現(xiàn)出抑制、促進(jìn)[4-5]等作用，此外BMP-2能促進(jìn)新骨的形成，同時(shí)新生出血管。已有大量研究證實(shí)MSC對(duì)HSC具有增殖作用[6]，其依賴(lài)于細(xì)胞直接接觸間的相互作用、分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子[7-8]，且接觸比非接觸共培養(yǎng)具有更強(qiáng)的擴(kuò)增作用[9]。本研究利用Transwel的上室底部網(wǎng)板微孔直徑僅0.4 μm，使得上室的HSC不能進(jìn)入下室，排除了細(xì)胞間直接接觸對(duì)HSC增殖的影響，但細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以通過(guò)該微孔，利于探討這種作用可能是通過(guò)MSC分泌的細(xì)胞因子促進(jìn)了HSC的增殖。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；鼠抗人ECD-CD34、PEcy7-CD45、FITC-CD105、IgG抗體（美國(guó)Pharminge公司）；鼠抗人FITC-Ki67抗體（上海雷浩信息科技有限公司）；干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、白介素-3（interleukin-3，IL-3）（美國(guó)Peprotech公司）；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）（RD公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMAN公司），Mini MACS免疫磁性吸附柱分離裝置和CD34+細(xì)胞選擇試劑盒（德國(guó)Mitenyi Biotec公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司），PCR試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）；Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；引物：β-actin上游AGAGATGGCCACGGCTGCTT，下游ATTTGCGGTGGACGTGGAG，Ki67上游CAAGCCACA？鄄GTCCAAGAGAA，下游GTGTCCATAGCTTTCCCTAC？鄄TG（上海生工生物工程股份有限公司）；Transwell小室（美國(guó)Costar公司）；PCR儀（羅氏公司）；熒光顯微鏡（羅氏公司）等。

1.2 方法

1.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

取年齡20～45歲健康正常人髂骨骨髓液（經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及取得供者知情同意），與完全培養(yǎng)基按體積比為1∶4混合后于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)（完全培養(yǎng)基成分為89%LD-DMEM+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素）。3 d換液1次，細(xì)胞融合達(dá)80%用0.25%胰蛋白酶消化1∶2傳代，傳至第三代（P3）備用，流式檢測(cè)MSC表面抗原CD105、CD34-ECD及CD45。

1.2.2 CD34+細(xì)胞的分選及純度鑒定

用Ficoll分選骨髓液中單個(gè)核細(xì)胞，根據(jù)miniMACS免疫磁性吸附柱分離裝置，用CD34+細(xì)胞選擇試劑盒按照其說(shuō)明進(jìn)行CD34+細(xì)胞的分離。流式檢測(cè)所分選細(xì)胞的純度。

1.2.3 共培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)分四組，HSC組：HSC單獨(dú)培養(yǎng)，HSC+BMP2組：HSC添加BMP-2蛋白，HSC+MSC組：HSC種于Transwell上室、MSC種于下室，HSC+MSC+BMP2組：共培養(yǎng)并添加BMP-2，每組4復(fù)孔。CD34+細(xì)胞1.0×105個(gè)/孔，MSC 3.0×106個(gè)/孔，rhBMP-2濃度為100 ng/mL，每孔總體積700 μL（89%IMDM+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素，IL-3濃度10 ng/mL、SCF50 ng/mL）。重復(fù)3次。

1.2.4 檢測(cè)HSC的增殖情況

培養(yǎng)72 h后收集HSC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC的表面抗原CD34的表達(dá)情況；計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)造血干細(xì)胞的數(shù)目，Trizol法提取HSC的RNA并用紫外線(xiàn)分光光度儀測(cè)其濃度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)其Ki67 mRNA的表達(dá)；細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定，破膜，封閉，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Ki67抗體孵育，洗滌等處理后，熒光顯微鏡觀(guān)察Ki67在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分選出的細(xì)胞的生物學(xué)鑒定

2.1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞

2.1.1.1 原代培養(yǎng)72 h可見(jiàn)散在的梭形貼壁細(xì)胞，第14天細(xì)胞融合度可達(dá)80%～90%，排列成放射狀、漩渦轉(zhuǎn)。P3代細(xì)胞在24 h內(nèi)大多能貼壁。見(jiàn)圖1。

2.1.1.2 流式鑒定第三代MSC的CDl05、CD34、CD45表達(dá)，MSC表達(dá)非造血相關(guān)免疫標(biāo)記CDl05，不表達(dá)造血相關(guān)免疫標(biāo)記CD34、CD45。見(jiàn)圖2。

2.1.2 造血干細(xì)胞

經(jīng)磁珠分選后的CD34+細(xì)胞呈大小均一的小圓形，經(jīng)胎盤(pán)蘭染色后98%細(xì)胞拒染。流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)磁珠分選后的CD34+細(xì)胞的純度為86.3%。

2.2 共培養(yǎng)第3天各組HSC的免疫表型

共培養(yǎng)3 d收集各組HSC，流式檢測(cè)其表面抗原CD34的表達(dá)，各組HSC仍高表達(dá)CD34，均高于80%。見(jiàn)圖3。

2.3 共培養(yǎng)第3天各組HSC的增殖比較

2.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)及熒光定量PCR

HSC的細(xì)胞計(jì)數(shù)、總RNA及增殖活性基因Ki67的表達(dá)在HSC+MSC+BMP2組高于HSC+MSC組，HSC+MSC組高于HSC組，HSC+BMP2組高于HSC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3.2 Ki67免疫熒光

FITC標(biāo)記的Ki-67在各組HSC上表現(xiàn)為片狀翠綠色熒光，顯示Ki-67蛋白的分布基本覆蓋整個(gè)細(xì)胞核。且可以看出Ki67熒光強(qiáng)度在HSC+MSC+BMP2組高于HSC+MSC組，HSC+MSC組及HSC+BMP2組高于HSC組。見(jiàn)圖4（封三）。

3 討論

全骨髓貼壁法是目前培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的重要方法之一，有操作簡(jiǎn)便、所培養(yǎng)出的細(xì)胞活性高等優(yōu)點(diǎn)。我們采用該方法培養(yǎng)出的MSC具有貼壁生長(zhǎng)的特性，其生長(zhǎng)特點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道的相符合[10-11]，表達(dá)非造血相關(guān)免疫標(biāo)記CD105，而不表達(dá)造血相關(guān)免疫標(biāo)記CD34和CD45，且在前期的實(shí)驗(yàn)中本課題組已對(duì)其成骨、成脂能力進(jìn)行鑒定[12]。CD34仍然是目前公認(rèn)的分選造血干細(xì)胞的主要免疫標(biāo)記，本研究應(yīng)用免疫磁珠法分選出的CD34+造血干細(xì)胞的純度及活性高。

Ki67基因與細(xì)胞增殖相關(guān)，其表達(dá)的核蛋白，與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)，在增殖期細(xì)胞表達(dá)，靜止期細(xì)胞不表達(dá)。Ki67的陽(yáng)性率越高，細(xì)胞增殖越活躍。本研究應(yīng)用PCR法及免疫熒光兩種方法檢測(cè)Ki67在不同組中的表達(dá)，以比較HSC的增殖能力。此外，細(xì)胞數(shù)目的增加及增殖能力的增強(qiáng)可伴有總RNA增加。故本研究選用細(xì)胞計(jì)數(shù)、總RNA、Ki67來(lái)評(píng)估不同干預(yù)條件下HSC的增殖能力，并且發(fā)現(xiàn)BMP-2和/或MSC可以促進(jìn)HSC增殖，且增殖后的HSC經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)鑒定仍高表達(dá)CD34。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Transwell將MSC與HSC進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)，根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC可以促進(jìn)HSC增殖，這可能是MSC分泌了相關(guān)的活性物質(zhì)經(jīng)Transwell的下室穿過(guò)Transwell的網(wǎng)膜進(jìn)入上室，促進(jìn)HSC增殖。BMP/TGF-β家族對(duì)HSC的調(diào)控作用很復(fù)雜，且與特定環(huán)境的精細(xì)調(diào)控相關(guān)[13-15]。BMP-2對(duì)HSC增殖的影響與HSC培養(yǎng)的時(shí)間及模式、BMP-2的濃度以及所聯(lián)合的細(xì)胞因子種類(lèi)等具體的環(huán)境相關(guān)[13-16]。本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3 d濃度為100 ng/mL的BMP-2有促進(jìn)HSC增殖的作用。rhBMP-2在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)MSC的增殖[17]，并能促進(jìn)MSC分泌造血生長(zhǎng)因子，如IL-6、IL-11、G-CSF和SCF等。根據(jù)本研究，BMP-2協(xié)同MSC較MSC單獨(dú)對(duì)HSC的增殖作用更強(qiáng)，說(shuō)明BMP-2協(xié)同MSC對(duì)HSC有增殖作用，由此推測(cè)這種增殖作用可能是BMP-2促進(jìn)MSC分泌了促HSC增殖的相關(guān)因子。

研究表明[18]BMP信號(hào)通路可通過(guò)成骨niche，也可能通過(guò)血管niche調(diào)控造血[19]。與前者相比，血管niche能促進(jìn)HSC增殖、分化[20]。本研究發(fā)現(xiàn)的BMP-2協(xié)同MSC對(duì)HSC的增殖作用是否是通過(guò)促進(jìn)血管形成相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)相關(guān)，在下一步實(shí)驗(yàn)中我們將繼續(xù)探討。

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（收稿日期：2018-00-00 本文編輯：任 念）