陳 佩 岳巧云 劉德星 陳利偉 邱德義* 何秋星

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州 510006；2.中山出入境檢驗檢疫局）

1 前言

細菌是非常重要的一類生物種群，與人類健康和社會發(fā)展息息相關(guān)[1]，一直是檢驗檢疫領(lǐng)域的重點檢測對象，尤其在國境衛(wèi)生檢疫中，口岸醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶病原體的檢測對于防止蟲媒傳染病通過國境口岸輸入、輸出發(fā)揮著重要作用，而細菌作為病原體的一種，如何快速、準(zhǔn)確、全面地將其鑒定檢測出，是防控的基礎(chǔ)和前提[2]。傳統(tǒng)的細菌研究方法主要分為兩類，一是基于對細菌分離培養(yǎng)的生化鑒定方法，但絕大多數(shù)（99%以上）細菌無法在現(xiàn)有實驗室條件下進行培養(yǎng)[3-4]；二是基于特異引物/探針/抗體的方法，均依賴于已知細菌的基因組序列，對于檢測未知的病原體存在很大的局限性[5]。

宏基因組學(xué)的興起以及二代測序技術(shù)的迅速發(fā)展，可同時對上百份樣本進行高通量核酸分子測序[6]，不依賴于細菌的分離培養(yǎng)，直接對樣品中所有的細菌進行研究，進而可以全面地對所有細菌進行檢測分析[7]。目前二代測序技術(shù)已廣泛運用于多個領(lǐng)域不同樣品中攜帶細菌的檢測分析，包括土壤[8]、人體腸道[9]、水體[10]、空氣[11]、媒介生物[12-13]等，然而從最初的細菌核酸提取到后期的數(shù)據(jù)分析，二代測序技術(shù)的結(jié)果質(zhì)量會受到多方面因素的影響，如細菌DNA的提取方法[14-15]，16S rRNA高變區(qū)的選擇[16-17]，測序文庫的構(gòu)建，測序平臺和策略的選擇[5]等。在實際檢驗檢疫應(yīng)用中，基于攜帶病原體的宿主不同，待檢樣品中細菌物種多樣性豐富，細菌DNA的提取作為后續(xù)擴增、測序和分析的基礎(chǔ)，如何高效率、全面地提取出樣品中的細菌DNA，對于結(jié)果的影響尤為突出。目前細菌DNA的提取方法多種多樣，原理各不相同，各有其優(yōu)缺點[18]。本研究比較了細菌的6種DNA提取方法，對混合細菌樣本進行DNA提取，并特異性地擴增16S rRNA的V3-V4高變區(qū)基因，構(gòu)建文庫并分析測序結(jié)果中各種細菌的含量和相對分布，從而得到一種高效、適用范圍廣的細菌核酸提取方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗樣品

實驗菌株共10種，包含5種革蘭氏陽性菌，分別為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌 （Bacillus cereus）、 糞腸球菌（Streptococcus faecalis）、馬紅球菌（Rhodococcus equi）、英諾克李斯特氏菌（Listeria innocua），以及5種革蘭氏陰性菌，分別是肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、綠膿桿菌 （Pseudomonas aeruginosa）、 大腸埃希菌（Escherichia coli）、腸沙門菌（Salmonella enterica）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）。以上菌株均為普通瓊脂斜面保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株，由中山出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心提供。

2.1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：MagPure Bacterial DNA KF Kit（Megen生物）；TIANamp Bacteria DNA Kit（天根生化科技有限公司）；GCM107營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；溶菌酶（源葉生物 R21037）；蛋白胨（AOBOX）；牛肉膏 （廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

儀器：全波長酶標(biāo)儀（Thermo ScientificTMMulti skanTMGo）；超聲波破碎儀（Sonics Vibra-Cell）；核酸提取儀（Thermo KingFisher Duo Prime）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠成像儀（UVltec）；PCR 儀（Life Technologies applied biosystems）；恒溫搖床（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 單一菌種的培養(yǎng)及分子鑒定

2.2.1.1 菌種培養(yǎng)

采用分區(qū)劃線法分別將10種菌株接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h。隨機挑取3個單菌落分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37℃、150 r/min恒溫搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，得到細菌菌液，保存于4℃冰箱備用。

2.2.1.2 細菌DNA提取

分別取10種細菌菌液1 mL置于1.5 mL離心管中，用核酸提取儀提取DNA，按照MagPure Bacterial DNA KF Kit說明書進行樣品前處理，得到樣品消化液之后，采用核酸提取儀中的MagPure_Bacterial_DNA_Duo程序提取DNA。

2.2.1.3 PCR擴增

擴增細菌樣本16S rRNA基因，引物序列為：正向引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3′）[19]，PCR 體系為 50 μL：10 倍 PCR 緩沖液 5 μL；正向引物（20 μmol/L）和反向引物（20 μmol/L）各 2 μL；dNTP （10 μmol/L） 2 μL；Ex-Taq 1 μL；模板DNA 3 μL；無菌水定容至50 μL。PCR反應(yīng)條件 ：95℃ 變 性 5 min；94℃ 、40 s，50℃ 、30 s，72℃ 、2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測（100 V電壓，340 mA電流，電泳緩沖液為1×TAE，電泳25 min），凝膠系統(tǒng)成像并記錄。

2.2.1.4 測序及同源性分析

采用PCR產(chǎn)物直接測序，將PCR產(chǎn)物送交上海立菲生物科技有限公司測序，測序引物同擴增引物。將測序所得序列去除兩端引物部分，并與Gen-Bank中相關(guān)序列進行同源性分析。利用Maga 6.0軟件中的Test Maximum Likelihood tree，對10種細菌樣品的16S rDNA基因序列進行ML進化樹的分析。

2.2.2 制備混合菌液

以澆注平板培養(yǎng)法進行細菌計數(shù)，將10種菌液梯度稀釋至 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8cfu/mL 共 5 個濃度梯后，分別吸取每個梯度的混勻菌液0.2 mL于無菌平皿中，及時倒入15～20 mL冷卻至46℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)動平板混勻，待平板凝固后，37℃倒置培養(yǎng)48 h；每個濃度梯度設(shè)置兩個平行。按照GB 4789.2—2010統(tǒng)計菌落數(shù)，并計算菌液濃度。根據(jù)細菌計數(shù)的結(jié)果，分別取濃度數(shù)量級為108cfu/mL的10種細菌樣本的菌液等量混勻，得到濃度數(shù)量級為107cfu/mL的混合菌液備用。

2.2.3 混合細菌的DNA提取

采用6種不同的方法分別提取混合菌液的DNA，每組設(shè)置3個平行樣，提取出的DNA作為模板DNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?種提取方法如下。

2.2.3.1 磁珠法

取1 mL混合菌液于1.5 mL離心管中作為實驗樣品，具體步驟同2.2.1.2。其提取原理是基于高結(jié)合力的磁珠粒子的純化方式，在高濃度的離子化合劑條件下，磁珠可通過氫鍵和靜電作用吸附核酸，而蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)不被吸附，吸附了核酸的磁珠經(jīng)洗脫去除蛋白和鹽，然后用ddH2O洗脫最終得到的DNA溶液。

2.2.3.2 熱裂解法

取1 mL混合菌液于1.5 mL離心管中，95℃熱裂解10 min，13 000 g離心2 min收集上清至1.5 mL離心管中。

2.2.3.3 超聲波法

取1 mL混合菌液于5 mL養(yǎng)菌管中，置于冰盒上超聲間歇處理5 min（超聲2 s，間隔5 s，功率20%）[20]，超聲處理完后，13 000 g離心 2 min收集上清至1.5 mL離心管中。

2.2.3.4 試劑盒法（溶菌酶處理）

取1 mL混合菌液于1.5 mL離心管中作為實驗樣品，按照TIANamp Bacteria DNA Kit說明書提取細菌DNA。

2.2.3.5 試劑盒法（無溶菌酶處理）

除了在樣品消化過程中不加入溶菌酶，略過步驟2，其余操作步驟同2.2.3.4。

2.2.3.6 超聲+熱裂解法

取1 mL混合菌液于5 mL養(yǎng)菌管中，置于冰盒上超聲間歇處理5min（超聲2s，間隔5s，功率20%），超聲處理完后，95℃熱裂解10 min，13 000 g離心2 min收集上清至1.5 mL離心管中。

2.2.4 混合菌液DNA的PCR擴增

分別以6種方法提取出的混合菌液DNA為模板，擴增其16S rRNA的V3-V4高變區(qū)基因。擴增引物為：正向引物 341F（5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′）和反向引物 806R（5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′）[21]，PCR 體系為 50 μL：2×PCR 緩沖液 25 μL；正向引物（20 μmol/L）和反向引物（20 μmol/L）各 1 μL；dNTP（10 μmol/L） 2.5 μL；KOD FX Neo 1μL；模板 DNA 3μL；無菌水定容至50μL。PCR反 應(yīng) 條 件 ：94℃ 變 性 2 min；98℃ 、10 s，50℃ 、30 s，68℃、30 s，30個循環(huán)；68℃延伸 10 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，PCR經(jīng)產(chǎn)物電泳檢測（100 V電壓，340 mA電流，電泳緩沖液為 1×TAE，電泳 25 min），凝膠系統(tǒng)成像并記錄。

2.2.5 二代測序及數(shù)據(jù)處理

PCR產(chǎn)物直接送交華大基因科技有限公司進行測序，采用Illumina HiSeqTM2000測序平臺，測序策略為PE300。測序流程主要為：先對樣品進行檢測，DNA總量不低于1.5 μg即可滿足建庫測序要求；然后回收目的Amplicon片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK 將打斷形成的粘性末端修復(fù)成平末端，再通過3'端加堿基“A”，使得DNA片段能與3'端帶有“T”堿基的特殊接頭連接；最后，用合格的文庫進行cluster制備和測序。下機數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的reads后，通過reads之間的overlap關(guān)系拼接成Tags，拼接的Tags經(jīng)過優(yōu)化后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU（Operational Taxonomic Units）。

2.2.6 不同提取方法的比較

對于6種提取方法主要從兩方面進行評價，一方面，提取出的混合細菌DNA是否滿足二代測序建庫的要求，包括：（1）PCR產(chǎn)物的電泳條帶是否清晰明亮；（2）PCR產(chǎn)物中目的DNA總量不低于1.5 μg。另一方面，二代測序結(jié)果是否能反應(yīng)樣品的真實情況，包括：OTU數(shù)、細菌種類的鑒定、不同細菌的相對含量分布情況。測序結(jié)果中OTU的豐度說明了樣品的物種豐富程度，通過統(tǒng)計測序結(jié)果中OTU的數(shù)量以及每個OTU所對應(yīng)的序列數(shù)，可得到樣品中細菌種數(shù)及不同細菌的相對含量，然后將測序結(jié)果與樣品的實際情況進行比較，從而分析不同方法之間細菌種類鑒定和相對含量分布準(zhǔn)確性的差異。

3 結(jié)果

3.1 單一菌種的鑒定

凝膠電泳成像后，擴增16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物均有長度約為1 500 bp的條帶。將測序所得序列去除兩端引物部分，并與GenBank中相關(guān)序列進行同源性分析，結(jié)果詳見表1，10種細菌均能被準(zhǔn)確鑒定到種的水平，表明了實驗菌種的準(zhǔn)確性。

表1 10種細菌樣本的鑒定結(jié)果

將10種細菌的16S rRNA及其V3-V4高變區(qū)基因序列分別進行ML樹分析 （圖1），16S rRNA基因序列進化樹表明10種細菌的進化距離較遠，運用16S rRNA基因序列能將其準(zhǔn)確地劃分到不同的種；而在16S rRNA V3-V4高變區(qū)基因序列進化樹中，僅大腸埃希氏菌和弗氏志賀菌未被區(qū)分開。

圖1 10種細菌的進化樹分析圖

3.2 6種方法中混合細菌的鑒定

3.2.1 混合細菌DNA的濃度、純度及PCR結(jié)果

由表2可知，6種方法中，磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）提取出的DNA濃度較低，均值低于10 ng/μL，其余4種方法的濃度相近，均值大于40 ng/μL；熱裂解法提取出的DNA純度最低，其余5種方法純度均大于1.6，其中試劑盒法（溶菌酶處理）的純度最高。

表2 6種提取方法所得細菌DNA的濃度及純度測定結(jié)果

6種方法提取出的混合細菌DNA濃度和純度各不相同，但經(jīng)PCR擴增后，凝膠成像見圖2，均有長度約為550 bp的明亮條帶，且其PCR產(chǎn)物中目的片段的總量均不低于1.5 mg，滿足建庫測序的要求。

圖2 混合菌液DNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

3.2.2 二代測序結(jié)果

3.2.2.1 OTU豐度分析

混合菌液樣本中共包含10種細菌，理想的測序結(jié)果應(yīng)該是將所有序列聚類為10種OTU，并且對OTU進行物種注釋能準(zhǔn)確地鑒定出樣品中的10種細菌。磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）測序結(jié)果的OTU數(shù)均為9，無雜質(zhì)OTU，其余4種方法的OTU數(shù)均大于10，其中超聲法的OTU均數(shù)為15，試劑盒法（無溶菌酶處理）為12，熱裂解法和超聲+熱裂解法的OTU數(shù)均超過了30。表明通過磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）提取細菌DNA，其測序結(jié)果中OTU的數(shù)目與樣品的真實數(shù)目最為接近。

3.2.2.2 菌種種類鑒定

由表3可知，6種方法的測序結(jié)果中均只能將5種細菌鑒定到種的水平，分別為腸沙門氏菌、大腸埃希氏菌、馬紅球菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌，將4種細菌鑒定到屬的水平，分別為克雷伯氏菌屬、李斯特氏菌屬、腸球菌屬和假單胞菌屬，而弗氏志賀氏菌均未被鑒定出。

3.2.2.3 菌種相對數(shù)量

混合菌液樣品中10種細菌均是等量加入，而在測序結(jié)果中，同一方法不同菌種的相對數(shù)量分布各不相同，馬紅球菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌屬的量在磁珠法、試劑盒法（溶菌酶處理）和超聲+熱裂解法中明顯低于平均值（10%）；熱裂解法中大腸埃希菌和假單胞菌屬的量，以及超聲法中假單胞菌屬的量遠高于平均值，而這兩種方法中其余菌種的量均較低；試劑盒法（無溶菌酶處理）中除了假單胞菌屬遠高于平均值以及大腸埃希菌和克雷伯菌屬的量接近平均值，其余菌種的量均低于平均值。不同方法之間，同一菌種的分布也不相同；馬紅球菌和李斯特菌屬在試劑盒法（溶菌酶處理）中提取得率最高，金黃色葡萄球菌在試劑盒法（無溶菌酶處理）中最高，但這3種菌在6種方法中提取率均低于平均值；蠟樣芽孢桿菌和腸球菌屬的量僅在磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）中高于平均值；而大腸埃希菌除了在超聲法中得率低于平均值，在其余5種方法中均較高；假單胞菌屬在6種方法中的得率均較高；腸沙門菌和克雷伯菌屬的量在熱裂解法和超聲法中均較低。

對6組測序結(jié)果中樣品菌種的相對分布進行統(tǒng)計，計算樣品菌種的序列數(shù)占總序列數(shù)的比例（表3），繪制柱狀圖，圖3直觀地反映了6種方法中樣品菌種的相對分布情況。由圖可觀察到磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）中各種細菌的含量分布相對均勻，最為接近樣品中細菌含量分布的真實情況。

表3 6種方法測序結(jié)果中不同細菌的序列條數(shù)分布

圖3 6種方法中各種細菌數(shù)據(jù)量的相對分布

4 討論

結(jié)果表明，6種提取方法對于二代測序結(jié)果的影響主要體現(xiàn)在OTU豐度和菌種相對數(shù)量上，磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）的OTU數(shù)最接近真實數(shù)量，無雜質(zhì)OTU；而超聲法和試劑盒法（無溶菌酶處理）比真實數(shù)量稍多，熱裂解法和超聲+熱裂解法則遠遠超過了真實數(shù)量；說明磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）測序結(jié)果較為準(zhǔn)確，其他4種提取方法對于OTU豐度有明顯影響，從而導(dǎo)致測序結(jié)果與真實結(jié)果相差較大。6種方法的二代測序結(jié)果中，菌種相對數(shù)量分布結(jié)果均不準(zhǔn)確，不同的提取方法對于細菌DNA的提取影響顯著，在同一方法中，不同細菌的提取效果差別很大，磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）的結(jié)果中各種菌的分布情況相對均勻，最能反映樣品中各種細菌含量的真實情況；對比試劑盒法（無溶菌酶處理）和試劑盒法（溶菌酶處理）的結(jié)果可知，可能是因為加入溶菌酶處理能減小細菌提取過程中所造成的結(jié)果偏倚；比較超聲+熱裂解法、熱裂解法和超聲法可知，超聲+熱裂解法相較于單獨的熱裂解法和超聲法其結(jié)果均勻度有所提高。對同一種細菌使用不同方法的提取效果差別也很大，在加入溶菌酶的磁珠法和試劑盒法中，蠟樣芽孢桿菌和大腸埃希氏菌的數(shù)據(jù)量遠高于另外4種不加溶菌酶的方法，說明溶菌酶處理對于樣本中蠟樣芽孢桿菌和大腸埃希氏菌的檢測至關(guān)重要。

本研究中，混合菌液樣品共加入10種細菌，特異性擴增細菌16S rRNA V3-V4高變區(qū)基因用于二代測序分析，而6種方法均未將弗氏志賀菌鑒定出來。弗氏志賀菌和大腸埃希菌屬于2個不同的屬，分別為志賀菌屬和埃希菌屬，圖1的ML進化樹表明了用16S rRNA基因可以準(zhǔn)確將這2種細菌區(qū)分開，但由于弗氏志賀菌的V3-V4高變區(qū)基因序列和大腸埃希菌的相似度為100%，無堿基差異，因此導(dǎo)致二代測序結(jié)果中未將2種細菌分開，可能將弗氏志賀菌都聚類為了大腸埃希菌，而這一結(jié)果也進一步驗證了擴增16S rRNA不同高變區(qū)基因會對細菌樣品構(gòu)成的分析結(jié)果產(chǎn)生明顯的影響[16-17]。

5 結(jié)論

綜合考慮6種方法對二代測序結(jié)果的影響，磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）用于提取混合細菌基因組DNA的效果最好，但其結(jié)果并不是十分理想，可能將多種方法結(jié)合使用會有更好的效果。鑒于傳統(tǒng)細菌鑒定檢測的不足，二代測序作為高通量快速檢測技術(shù)，給全面快速地檢測樣品，尤其是醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶細菌病原體的情況提供了可能，但二代測序結(jié)果質(zhì)量的影響因素較多，仍需后續(xù)更全面深入的研究和優(yōu)化。

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