，， ,2，

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150028)

0 引 言

大豆胞囊線蟲(Soybean cyst nematode，SCN)病是大豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的土傳病害，其病原為大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)。由于大豆胞囊線蟲以胞囊形式存在于土壤中，造成連作大豆胞囊線蟲病危害加重[1-2]，但Hartwig[3]和Chen等[4]報(bào)道連續(xù)多年種植大豆感病品種，可減少大豆胞囊線蟲在土壤中的密度，稱此現(xiàn)象為 “大豆胞囊線蟲自然衰退”，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的土壤被稱為“線蟲抑制性土壤”，這種現(xiàn)象在我國大豆主產(chǎn)區(qū)也有報(bào)道[5-8]，孫玉秋等研究發(fā)現(xiàn)，大豆長期連作后土壤中胞囊數(shù)量接近輪作土壤中的胞囊數(shù)量，并且胞囊中的卵量也降低[9]。孫漫紅等研究發(fā)現(xiàn)，抑制性土壤中的空胞囊數(shù)量增加，并認(rèn)為土壤中具有抑制因子可導(dǎo)致大豆胞囊線蟲衰退，并初步確定是食線蟲真菌的作用[10]。在美國也有報(bào)道大豆胞囊線蟲病土壤中雌蟲的寄生真菌有輔助鏈枝菌(Catenariaauxiliaris)、嗜雌線蟲菌(Nematophthoragynophila)和厚垣輪枝菌(Verticilliumchlamydosporium)[11]，這些真菌對(duì)降低大豆胞囊線蟲種群密度起了重要作用。2002年孫漫紅等發(fā)現(xiàn)在大豆連作多年土壤中胞囊定殖真菌數(shù)量較多，如淡紫擬青霉菌(Paecilomyceslilacinus)和厚垣輪枝菌[12]。Song等采用盆栽試驗(yàn)在21年大豆連作土壤中加入真菌抑制劑匹馬霉素和細(xì)菌抑制劑硫酸鏈霉素，證明了抑制性土壤中的真菌對(duì)控制大豆胞囊線蟲的作用大于細(xì)菌的作用[13]；宋潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)大豆連作20多年后，土壤中大豆胞囊線蟲不同蟲態(tài)上的厚垣輪枝菌和淡紫擬青霉菌分離數(shù)量明顯高于3 年連作和22 年輪作的。Song 等采用DGGE技術(shù)分析也得到了相同的結(jié)果[15]。陳立杰等報(bào)道連作6年的大豆田間土壤中鐮孢菌(Fusariumspp.)的分離頻率最高，認(rèn)為鐮孢菌與連作田中不飽滿胞囊數(shù)量增多有關(guān)[16]。近年來有許多研究證明了厚垣輪枝菌、鐮孢菌和淡紫擬青霉菌等對(duì)大豆胞囊線蟲的寄生和抑制具有一定的影響[17-18]。

淡紫擬青霉菌是一種重要的線蟲寄生真菌，能寄生在多種植物病原線蟲卵、幼蟲和成蟲中，其代謝產(chǎn)物中含有一定濃度的乙酸等可殺線活性物質(zhì)，抑制線蟲卵孵化和二齡幼蟲活性[19]。有研究表明，實(shí)驗(yàn)室條件下尖孢鐮孢芬芳變種(Fusariumoxysporumvar.redolens)和禾谷鐮孢菌(F.graminearum)發(fā)酵液，可有效地抑制大豆胞囊線蟲卵孵化，并對(duì)二齡幼蟲具有致死作用[20]。也有報(bào)道提出，厚垣輪枝菌發(fā)酵液同樣可抑制大豆胞囊線蟲卵孵化，使線蟲的二齡幼蟲致死[18,21]。Khan等研究表明，淡紫擬青霉菌的培養(yǎng)液能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶，并通過這兩種酶的作用破壞根結(jié)線蟲(Meloidogynejovanica)卵殼，而使菌絲侵入根結(jié)線蟲的卵并寄生于卵內(nèi)，因而有效地降低根結(jié)線蟲卵孵化成幼蟲[22]。但以往研究多集中于某種單一寄生真菌或發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲的作用，由于大豆田土壤中微生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，多種微生物并存。因此，本研究為了明確寄生真菌對(duì)大豆胞囊線蟲作用，采用大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)寄生菌群，探討其發(fā)酵液混合后對(duì)大豆胞囊線蟲的毒性大小，旨在為生產(chǎn)中大豆胞囊線蟲的生物生態(tài)防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試寄生真菌、線蟲及大豆品種

寄生真菌為淡紫擬青霉菌4個(gè)菌株(P-1、P-V、P-40和P-E)、鐮孢菌屬4個(gè)菌株(F-1、F-5、F-9和F-V)和厚垣輪枝菌4個(gè)菌株(V-1、V-2、V-21和 V-25)。供試真菌由中國科學(xué)院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從大豆胞囊線蟲抑制性土壤中分離、保存，并鑒定其對(duì)寄生大豆胞囊線蟲的致病性，結(jié)果顯示供試菌株寄生大豆胞囊線蟲胞囊、卵后可有效抑制線蟲孵化并使二齡幼蟲(J2)致死[23]。測(cè)定供試菌株的單獨(dú)發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲毒力也表明其對(duì)大豆胞囊線蟲胞囊、卵和J2的毒性[20,24]。

供試線蟲為大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種，該小種是我國大豆主產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢(shì)小種。盆栽試驗(yàn)，供試大豆品種為合豐25，該品種對(duì)大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種感病。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)[25]和水瓊脂培養(yǎng)基(WA)。

1.2 寄生真菌發(fā)酵液制備

將每個(gè)供試菌株分別挑取菌絲在PDA培養(yǎng)基上活化7 d后打取直徑為4 mm的菌塊15塊，接種于100 mL PDB培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h作為種子液。取4 mL種子液，接種到120 mL PDB培養(yǎng)液中，相同條件下震蕩培養(yǎng)5 d，在4 ℃條件下離心20 min (10 000 r·min-1)，上清液用細(xì)菌過濾器過濾，即為寄生真菌發(fā)酵原液。

1.3 大豆胞囊線蟲胞囊分離和卵及二齡幼蟲(J2)懸液制備

取田間5～20 cm耕層大豆根圍土，進(jìn)行線蟲胞囊分離。將新鮮土在燒杯中加清水?dāng)嚢?，浸? h后過套篩(20目和80目)，將80目篩上的殘留物用63%蔗糖收集到離心管中，離心5 min(2 500 r·min-1)，將殘留物過濾，挑取成熟飽滿的線蟲胞囊，放4 ℃冰箱保存。

將飽滿胞囊放入套篩(200目和500目)中研磨，收集殘留物，用0.5% NaClO溶液消毒，清水沖洗，用滅菌水制備卵懸液，調(diào)整濃度到5 000個(gè)·mL-1，放4 ℃冰箱保存。

將線蟲卵置于420目篩網(wǎng)布上，放入含0.4 mmol·L-1ZnCl2溶液的孵化池中，25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵化。

1.4 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲毒力測(cè)定

按1.2方法制備的3種寄生真菌發(fā)酵液按1∶1∶1比例混合[26]，采用正交試驗(yàn)，篩選優(yōu)勢(shì)寄生菌組合，見表1。

表1 菌株混合方式正交表Table 1 Orthogonal table of mixed parasitic fungal strains

1.4.1 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)SCN胞囊孵化的影響。新鮮飽滿的線蟲胞囊分別置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔10個(gè))，每孔加入2 mL混合寄生真菌發(fā)酵液，以空白培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d記錄孵化的線蟲數(shù)，計(jì)算孵化抑制率。

孵化抑制率(%)=(對(duì)照孵化線蟲數(shù)-處理孵化線蟲數(shù))/對(duì)照孵化線蟲數(shù)×100%

1.4.2 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)SCN卵孵化的影響。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入線蟲卵懸液，每孔0.4 μL(約200粒)，每孔加入2 mL混合寄生真菌發(fā)酵液，以空白培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d記錄孵化的線蟲數(shù)，計(jì)算孵化率和相對(duì)抑制率。

孵化率(%)=孵化線蟲數(shù)×100/供試卵數(shù)

相對(duì)抑制率(%)=(對(duì)照孵化率-處理孵化率)×100/對(duì)照孵化率

1.4.3 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)SCN J2毒力測(cè)定。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入線蟲J2(每孔約50條)，每孔加入2 mL混合寄生真菌發(fā)酵液，以空白培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在1 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后記錄線蟲死亡數(shù)量，計(jì)算線蟲死亡率。

線蟲死亡率(%)=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)×100%

1.5 寄生真菌發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲防效

試驗(yàn)設(shè)3種處理：空白對(duì)照、接種大豆胞囊線蟲J2、施入混合寄生真菌發(fā)酵液+接種大豆胞囊線蟲J2。選擇室內(nèi)測(cè)定結(jié)果中對(duì)大豆胞囊線蟲3種蟲態(tài)毒力強(qiáng)的真菌發(fā)酵液4個(gè)組合，進(jìn)行溫室盆栽試驗(yàn)，接種二齡幼蟲35 d后調(diào)查混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲的防治效果。

試驗(yàn)用土取自菜地，經(jīng)分離測(cè)定無大豆胞囊線蟲胞囊，土和河沙均過20目孔篩，經(jīng)121 ℃高壓滅菌1 h。將土和沙子按2∶1比例混合，盆中加入300 cm3滅菌沙土?；ㄅ璧讖? cm、口徑10 cm、高8 cm。在溫室內(nèi)無菌蛭石中播種大豆，7 d后每盆移栽豆苗2株，置于溫室中生長，4次重復(fù)。大豆胞囊線蟲J2接種量為1 500條·株-1，混合寄生真菌發(fā)酵液施入量為100 mL[27]。大豆出苗35 d后扣盆，用清水沖洗掉根系土壤，測(cè)定大豆株高、大豆地上和根系鮮重。清水沖洗根系后計(jì)數(shù)根表大豆胞囊線蟲雌蟲數(shù)量。

大豆根內(nèi)J2、胞囊及卵分離和測(cè)定：將新鮮去土的大豆根在-20 ℃冰箱中冷凍24 h，取出室溫下融化，加適量水后在組織搗碎機(jī)中搗碎。將溶液轉(zhuǎn)移到套篩網(wǎng)上(80目和500目)，500目篩上物用蔗糖離心法分離[28]，同時(shí)將黏在離心管壁和蓋內(nèi)的線蟲進(jìn)行收集清洗。體式顯微鏡下計(jì)數(shù)J2數(shù)量。胞囊及卵分離測(cè)定同1.3。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)胞囊孵化的影響

對(duì)大豆胞囊線蟲在混合寄生真菌發(fā)酵液中胞囊孵化結(jié)果調(diào)查表明，16組混合寄生真菌發(fā)酵液均對(duì)胞囊孵化具有強(qiáng)烈抑制作用，孵化抑制率在59.1%～87.8%，與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)，見表2。

表2 混合寄生真菌發(fā)酵液組合的大豆胞囊線蟲胞囊孵化抑制率Table 2 Inhibition rates of SCN cyst hatch in mixed fermentation filtrate

注:數(shù)字后字母為Duucan′S新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)結(jié)果，不同英文字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note：Means in column followed by the different capital letter(s)indicate significant differences according to the Duucan′S multiple range test at 0.01 level.The same is as below.

其中F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和 F-9+P-E+V-21處理的孵化抑制率均為80%以上，極顯著高于其他處理；F-1+P-40+V-21、F-1+P-1+V-25、F-5+P-1+V-21、F-5+P-V+V-2和F-5+P-E+V-1處理的混合寄生真菌發(fā)酵液的孵化抑制率稍低一些，抑制率在59%～60%。

2.2 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)卵孵化影響

16個(gè)混合寄生真菌發(fā)酵液組合均對(duì)大豆胞囊線蟲卵孵化均具有顯著抑制作用，處理的卵孵化率在2.3%～4.2%，均極顯著低于空白對(duì)照，見表3；卵孵化相對(duì)抑制率在72.1%～84.7%。其中F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和F-9+P-E+V-21孵化相對(duì)抑制率為81%～85%，顯著高于其他處理(P<0.05)，與胞囊孵化試驗(yàn)結(jié)果一致，說明對(duì)大豆胞囊線蟲的抑制效果穩(wěn)定。

表3 混合寄生真菌發(fā)酵液中大豆胞囊線蟲卵孵化率和相對(duì)抑制率Table 3 The SCN egg hatch rates and relative hatch inhibition rates of in mixed fermentation filtrates

注:大寫英文字母表示差異極顯著(P<0.01),小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note：Captial letters mean significant differences at 0.01 level；Small letters mean significant differences at 0.05 level.The same is as below.

2.3 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)J2毒力

試驗(yàn)結(jié)果表明16組混合寄生真菌發(fā)酵液均對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲有致死作用，見圖1?；旌霞纳婢l(fā)酵液對(duì)J2的致死作用隨作用時(shí)間延長而增強(qiáng)，在1 h就顯現(xiàn)出致死作用，二齡幼蟲死亡率在13%～31%，24 h增至63%以上，48 h增至94%以上，72 h達(dá)到了100%。16個(gè)處理中對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲毒力較強(qiáng)的仍是F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和 F-9+P-E+V-21組合，1 h時(shí)4個(gè)處理使二齡幼蟲迅速死亡，死亡率25.2%～31.3%，顯著高于其他處理；到24 h時(shí)，這4個(gè)處理的二齡幼蟲死亡率均高達(dá)90%以上；在48 h即達(dá)到了100%的二齡幼蟲死亡率，較其他處理提前了24 h。F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和 F-9+P-E+V-21處理與對(duì)胞囊和卵的抑制作用非常吻合。

圖1 寄生真菌發(fā)酵液中大豆胞囊線蟲二齡幼蟲死亡率Fig.1 Death rate of SCN J2 in mixed fermentation filtrates

2.4 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲防治效果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，施用混合真菌發(fā)酵液可明顯降低盆內(nèi)線蟲密度，見表4。施用混合真菌發(fā)酵液后，大豆根表雌蟲數(shù)量防效27.9%～40.7%，胞囊數(shù)量防效33.5%～41.2%，卵量防效36.3%～45.3%，根內(nèi)J2數(shù)量防效17.3%～38.3%，其中8號(hào)處理(F-9+P-E+V-21)對(duì)根表雌蟲、胞囊、卵量和根內(nèi)J2防效均在40%左右，綜合防治效果最為顯著。

表4 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)大豆胞囊線蟲控制效果Table 4 Control effects of mixed parasitic fungal fermentation filtrate on SCN

注(Note)：3：F-V+P-V+V-21；4：F-V+P-E+V-25；7：F-9+P-V+V-25；8：F-9+P-E+V-21

2.5 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)大豆生長發(fā)育的影響

盆栽試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果顯示，接種J2同時(shí)施用混合真菌發(fā)酵液與只接種J2處理相比，可增加大豆株高，提高大豆植株鮮重、根重及總鮮重，總鮮重增加范圍在17.9%～26.9%?；旌险婢l(fā)酵液4個(gè)處理組合中，以8號(hào)(F-9+P-E+V-21)發(fā)酵液對(duì)大豆生長影響較為明顯，但不同混合發(fā)酵液組合間差異不顯著；除3號(hào)處理(F-V+P-V+V-21)外，4號(hào)、7號(hào)和8號(hào)施用混合發(fā)酵液處理的株高均顯著高于只接種J2對(duì)照的株高；在只施用混合發(fā)酵液處理中，大豆植株總鮮重是8.1～8.7 g，植株高度范圍在25.4～26.0 cm，均與不施用混合發(fā)酵液對(duì)照(CK)差異不顯著(P>0.05)(表5)，說明4個(gè)處理均未對(duì)大豆生長造成負(fù)面影響。

表5 混合寄生真菌發(fā)酵液對(duì)大豆生長發(fā)育的影響Table 5 Effects of mixed parasitic fungal fermentation filtration on the growth and development of soybean

注(Note)：3：F-V+P-V+V-21；4：F-V+P-E+V-25；7：F-9+P-V+V-25；8：F-9+P-E+V-21

3 結(jié)論和討論

本研究發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉菌、厚垣輪枝菌和鐮孢菌的混合寄生真菌發(fā)酵液，可顯著降低盆栽中大豆胞囊線蟲各種蟲態(tài)的數(shù)量，對(duì)二齡幼蟲具有致死毒性，對(duì)SCN有顯著的抑制作用。而且，篩選出的4個(gè)組合不僅對(duì)大豆胞囊線蟲離體毒力強(qiáng)，而且對(duì)土壤中大豆胞囊線蟲的防控具有穩(wěn)定的效果。

淡紫擬青霉菌、厚垣輪枝菌和鐮孢菌這3種真菌在大豆田中普遍存在，尤其在長期連作大豆田中[14]。有研究認(rèn)為大豆胞囊線蟲寄生真菌可產(chǎn)生酶類物質(zhì)、毒素及對(duì)線蟲有毒害的其他次生代謝物質(zhì)[29]。不同真菌產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，殺線活性也不盡相同，而且不同的大豆胞囊線蟲寄生真菌都有其獨(dú)特的作用方式和機(jī)制。林茂松等[30]發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉菌培養(yǎng)濾液的代謝產(chǎn)物的生理活性物質(zhì)存在于蛋白組分中。此外，淡紫擬青霉菌能夠產(chǎn)生代謝物乙酸，該菌可寄生線蟲的卵而影響幼蟲生長發(fā)育，致使線蟲在胚胎中產(chǎn)生氣泡，從而使線蟲造成畸形或停止發(fā)育，甚至麻痹而死[22]。厚垣輪枝菌也可寄生在大豆胞囊線蟲的各蟲態(tài)中，對(duì)控制田間植物寄生線蟲種群密度起著重要的作用，也是歐洲燕麥胞囊線蟲衰退的主要原因[5]。也有報(bào)道輪枝菌產(chǎn)生一些替代物會(huì)導(dǎo)致南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)卵表面收縮并無活力，說明有幾丁質(zhì)降解酶或者一些其他活性物質(zhì)的產(chǎn)生[31]。Chen等[32]報(bào)道在線蟲胞囊上分離的茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)的發(fā)酵液對(duì)二齡幼蟲具有毒力。本研究采用這些大豆胞囊線蟲寄生真菌代謝物混合，可充分發(fā)揮單個(gè)寄生真菌的作用，從不同作用方式對(duì)大豆胞囊線蟲進(jìn)行抑制。室內(nèi)試驗(yàn)中F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和 F-9+P-E+V-21組合對(duì)大豆胞囊線蟲的胞囊、卵孵化抑制和對(duì)J2的致死作用非常一致，說明這些組合作用穩(wěn)定，此4組混合菌液對(duì)大豆胞囊線蟲的作用都很強(qiáng)。而且，發(fā)酵液可促進(jìn)大豆生長，降低其對(duì)大豆生長發(fā)育造成的危害，室內(nèi)抑制作用與土壤中施用效果反應(yīng)一致。因此，應(yīng)用不同生物活性的發(fā)酵液組成混合制劑能提高其環(huán)境適應(yīng)性而加強(qiáng)對(duì)線蟲的防治效果，值得進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)。

目前對(duì)大豆胞囊線蟲生物防治的研究多集中在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)線蟲的抑制作用及某種真菌活體菌劑的應(yīng)用，而發(fā)酵液對(duì)線蟲作用更直接迅速，對(duì)發(fā)酵液制備技術(shù)的研發(fā)和多種生防菌混合發(fā)酵液的開發(fā)需深入探討。應(yīng)用生防菌劑防治大豆胞囊線蟲等土傳病害，關(guān)鍵在于作物根際的生態(tài)環(huán)境，該微環(huán)境非常復(fù)雜，作物根際-線蟲-真菌相互關(guān)系、土壤溫濕度、pH、作物殘?bào)w、其它微生物的代謝產(chǎn)物、除草劑和農(nóng)藥等化學(xué)物質(zhì)的干擾，都會(huì)影響到生防真菌在田間應(yīng)用過程中防效的穩(wěn)定性，今后應(yīng)加強(qiáng)這些方面的研究。

致 謝

中國科學(xué)院“十三五”信息化專項(xiàng)科學(xué)大數(shù)據(jù)工程項(xiàng)目(XXH13505-07)。

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