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(黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

0 引 言

我國(guó)是養(yǎng)殖業(yè)大國(guó)，集約化養(yǎng)殖發(fā)展迅速。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止到2015年年底我國(guó)大牲畜飼養(yǎng)量約為1.2億頭，所產(chǎn)生的畜禽糞便高達(dá)2.5億噸[1-2]。大量產(chǎn)生的畜禽糞便如果處理不當(dāng)會(huì)嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境[3]。

近年來在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，為了預(yù)防和治療動(dòng)物疾病而大量使用抗生素[4]。2013年我國(guó)年抗生素使用量高達(dá)16萬噸，其中獸用抗生素占比達(dá)52%[5]。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)的抗生素使用量是美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家的5倍之多[6]。由于抗生素大多屬于水溶性，在家畜腸道內(nèi)的吸附利用率低，導(dǎo)致30%～90%的抗生素最終以母體的形式被排出到環(huán)境中[7-9]。這些抗生素在環(huán)境中長(zhǎng)期積累導(dǎo)致耐藥基因的產(chǎn)生，造成生態(tài)污染[10]。而且，畜禽糞便的處理不當(dāng)以及抗生素的大量殘留對(duì)生態(tài)環(huán)境造成復(fù)合污染。在眾多抗生素中，土霉素是目前作為獸用抗生素最為廣泛的四環(huán)素類抗生素，我國(guó)每年由養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的糞便中，抗生素殘留量高達(dá)2 170 t[11]，其所產(chǎn)生的污染亟待解決。堆肥化處理不僅可以有效解決畜禽糞便污染問題，同樣也可有效地降低抗生素含量[12-16]。目前對(duì)于抗生素在堆肥過程中的降解研究主要集中在抗生素的降解動(dòng)力學(xué)方面[13-14,17-19]，以及在抗生素污染環(huán)境中分離抗生素降解菌等方面[20-22]，而在堆肥過程中抗生素降解與微生物多樣性方面的研究較少。馬駿[23]通過Biolog微平板法研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素會(huì)在堆肥高溫期抑制微生物活性，而在腐熟期活性恢復(fù)。Su[24]研究利用定量PCR和16S rRNA發(fā)現(xiàn)在污泥堆肥中放線菌門在堆肥后期屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種。此外溫度普遍被認(rèn)為是影響抗生素降解的主要因素[25-26]，而堆肥體系中復(fù)雜的微生物生境常被忽視。

本研究系統(tǒng)地分析了堆肥過程中土霉素的降解對(duì)微生物群落的影響，明確堆肥過程中土霉素降解與微生物群落變化之間的關(guān)系，找到優(yōu)勢(shì)微生物菌群，并通過相關(guān)性分析溫度的影響，在減少土霉素殘留造成生態(tài)污染的同時(shí)，為進(jìn)一步解釋土霉素生物降解機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)原料所用新鮮牛糞購置于大慶市臥里屯奶牛場(chǎng)，柳樹葉采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校園落葉，通過液相色譜檢測(cè)均不含土霉素。土霉素(25萬單位)，購于大慶福斯特藥店，理化參數(shù)如表1所示。

表1 牛糞堆肥原料的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of cattle manure composting materials

1.2 堆肥體系的建立

將牛糞與柳樹葉按照體積比1∶1混合均勻，調(diào)節(jié)C/N為25～30之間，含水70%左右。根據(jù)土霉素初始含量設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn)，即對(duì)照組(CK)：土霉素初始含量為0，處理組(TG)：土霉素初始含量為60 mg·kg-1，每組3個(gè)重復(fù)。制成下體直徑1.2 m，高0.8 m的堆體，堆制周期共進(jìn)行63 d。

1.3 堆肥樣品采集及理化參數(shù)測(cè)定

堆置周期內(nèi)，每天對(duì)堆體溫度進(jìn)行測(cè)定，分別測(cè)定堆肥深層、中層和表層不同位置溫度，取平均溫度作為當(dāng)天堆體溫度，同時(shí)對(duì)環(huán)境溫度進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)堆體溫度變化，分別在第0、3 d、7 d、14 d、28 d及63 d從堆體中不同深度采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣，混合均勻后，將堆肥樣品加等體積PBS緩沖液(pH=7.02)放置于-20 ℃保存，用于微生物等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目分析。

1.4 土霉素含量測(cè)定

土霉素含量測(cè)定采用高效液相色譜-質(zhì)譜連用法進(jìn)行檢測(cè)。液相色譜色譜柱采用Innoval ODS-2(150×4.6 mm，5 μm)不銹鋼柱，流動(dòng)相為乙腈∶水(含0.1%甲酸)(3∶7，V/V)，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL·min-1。質(zhì)譜儀噴霧電壓為3.5 Kv，輔助氣壓10 arb，毛細(xì)管溫度為300 ℃，碎裂能量CID 35%，分別采用監(jiān)測(cè)離子m/z 461-m/z 426、m/z 461-m/z 443進(jìn)行定性以及定量分析。

1.5 樣品高通量測(cè)序

分別取堆肥原料、堆肥高溫期(14 d)以及堆肥腐熟期(63 d)樣品作為堆肥典型時(shí)期樣品用于分析微生物多樣性變化。每個(gè)樣品稱取0.2～0.5 g，采用改良的氯苯法對(duì)樣品總DNA進(jìn)行提取[26]。所提取的DNA樣品經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳用于檢測(cè)DNA完整性，使用Nanodrop 2000c(Thermo Fisher Scientific,American)進(jìn)行濃度檢測(cè)，所測(cè)OD260/280在1.8～2.2之間，濃度大于10 ng·ul-1，總量大于500 ng，凝膠電泳圖譜顯示主帶清晰。將提取合格的DNA樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行建庫測(cè)序。

1.6 微生物多樣性分析

測(cè)序數(shù)據(jù)的獲取及分析：利用Qiime(version 1.9.0)對(duì)原始序列進(jìn)行過濾處理，所有優(yōu)質(zhì)序列，隨后利用Usearch(version 8.0)去除所得嵌合體已獲得有效序列。

OTU聚類：利用Qiime中cd-hit方法對(duì)所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，以97%相似度為閾值將序列聚類成OTU，同時(shí)選取OTU的代表序列，并去除其中的singleton(所有樣品中只有一條序列的OTU)。

物種注釋：利用RDP Classifier(version 2.0)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種注釋分析。

Alpha多樣性分析：利用Qiime對(duì)ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simposn指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過程中溫度變化

整個(gè)堆肥過程中TG和CK溫度變化趨勢(shì)相同，呈現(xiàn)先迅速升高隨后下降的趨勢(shì)，見圖1。在堆肥前期，兩組實(shí)驗(yàn)溫度迅速升高至50 ℃以上，并分別持續(xù)了16 d和18 d。兩組實(shí)驗(yàn)最高溫均出現(xiàn)在第7 d，其中TG最高溫度為62.0 ℃，CK最高溫度為61.5 ℃，隨后溫度下降并趨于穩(wěn)定。

圖1 堆肥過程中溫度變化Fig.1 Temperature changes during composting

2.2 堆肥過程中土霉素含量變化

土霉素降解率隨堆肥的進(jìn)行呈上升趨勢(shì)，在高溫期時(shí)土霉素降解速率最快，堆肥后期趨于平緩，見圖2。堆肥前14 d共降解了68.3%的土霉素，截止到堆肥結(jié)束時(shí)，土霉素檢出量為2 mg·kg-1，土霉素去除率為96.7%。

2.3 堆肥過程中微生物群落多樣性分析

實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同溫度共采集5個(gè)樣品的DNA，經(jīng)高通量測(cè)序共獲得 732 409對(duì)原始序列，經(jīng)雙端拼接、過濾后共產(chǎn)生573 931條優(yōu)質(zhì)序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生114 786條。全部測(cè)序按相似度97%聚類分析中共得到896個(gè)OTUs，分屬于17個(gè)細(xì)菌門，43個(gè)綱，84個(gè)目，168科，341個(gè)屬，單樣品信息見表2。

圖2 堆肥過程中TG處理組土霉素變化情況Fig.2 Oxytetracycline changes with TG treatment during composting

表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of sample sequencing data

注：Material為原料樣本；CK 14和CK 63分別為空白組高溫期及腐熟期樣本；TG 14和TG 63為土霉素處理高溫期及腐熟期樣本。

Note: Material was the sample of raw materials;CK 14 and CK 63 as the sample of blank group at high temperature stage and maturity stage,respectively;TG 14 and TG 63 for oxytetracycline treatment group at high temperature stage and maturity stage,respectively.

基于α多樣性分析各樣品間物種豐富度和多樣性指數(shù)，其中ACE和Chao用來估計(jì)群落中含有OTU數(shù)目的指數(shù)，ACE和Chao指數(shù)越大，說明OTUs越高，見表2。在本研究中，各樣品按ACE和Chao排序依次為CK 14>TG 14>CK 63>TG 63>Material，說明CK 14 OTUs最高，這也驗(yàn)證了OTUs所得到的結(jié)果。在微生物多樣性方面，從Shannon中可以發(fā)現(xiàn)，在堆肥高溫期(CK 14及TG 14)微生物多樣性高于堆肥腐熟期(CK 63及TG 63)。

2.4 堆肥過程中細(xì)菌菌群分布及比較

基于高通量測(cè)序技術(shù)，通過物種注釋，在門的分類水平上5個(gè)樣本共檢測(cè)到17個(gè)細(xì)菌門，其中變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)在所有樣本中均為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(圖3a)，這些細(xì)菌門相對(duì)豐度之和在所有樣本中均占比90%以上，在原料中占比高達(dá)99%。

整個(gè)堆肥過程，在土霉素處理中變形菌門、厚壁菌門以及擬桿菌門較空白組相比，變化趨勢(shì)明顯不同。變形菌門在原料中占比42.9%(圖3a)，屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，隨堆肥進(jìn)行，在沒有土霉素的空白組中呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，截止到堆肥63 d其相對(duì)豐度為46.0%，而在土霉素污染脅迫下(TG組)，變形菌門趨勢(shì)與之相反，由初始的42.9%下降到高溫期的37.5%，盡管在堆肥腐熟期土霉素污染減弱(2 mg·kg-1)，其相對(duì)豐度仍繼續(xù)下降至23.0%，喪失了其優(yōu)勢(shì)菌群的地位。反觀厚壁菌門可以清楚的發(fā)現(xiàn)，在沒有土霉素堆肥過程中，厚壁菌門的生長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由初始的21.9%下降到堆肥腐熟時(shí)12.9%，而在土霉素污染脅迫下，厚壁菌門的相對(duì)豐度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，截止到堆肥腐熟期，其相對(duì)豐度為40.5%，成為主要優(yōu)勢(shì)菌群。擬桿菌門在空白組中相對(duì)豐度由初始的9.44%上升到高溫期的17.6%，隨后穩(wěn)定在17%，而在高土霉素污染下(高溫期)其相對(duì)豐度下降，由初始的9.44%下降到7.62%，當(dāng)土霉素污染減弱時(shí)(腐熟期)，其相對(duì)豐度又出現(xiàn)上升，其豐度為15.7%，見圖3a。

盡管變形菌門在高土霉素濃度下表現(xiàn)出低耐受性，但在變形菌門中假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、水微菌屬(Aquamicrobium)、Chelatococcus及Luteimonas等細(xì)菌屬在高土霉素濃度下相對(duì)豐度上升(圖3b)。其中水微菌屬、Chelatococcus以及假黃色單胞菌屬在高濃度土霉素條件下上升明顯，分別由初始的1.11%、0、0上升到6.02%、6.41%、2.38%，但隨土霉素的降解，在堆肥腐熟期時(shí)，這三種菌相對(duì)豐度明顯下降，且低于空白組見圖3b。

圖3(a) 門水平上主要微生物類群(相對(duì)豐度>5%);(b) 變形菌門屬水平上豐度上調(diào)主要微生物類群Fig.3(a) Major microbial groups at phylum level(relative abundance of >5%);(b) Major up-regulated microbial groups at proteobacteria level

在屬的水平上5個(gè)樣本共有341個(gè)屬被鑒定，其中在可注釋到的微生物中，豐度大于1%的共含有43個(gè)不同的細(xì)菌屬，見圖4a。隨堆肥進(jìn)行，在高溫期14 d時(shí)，類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Thermobacillus、芽孢桿菌(Bacillus)在內(nèi)的部分細(xì)菌屬表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)(圖4b，表3)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，由初始的0.04%、0、0上升至4.25%、1.68%和1.16%，而在沒有土霉素處理的空白組中其相對(duì)豐度仍保持在較低水平(相對(duì)豐度<0.1%)。在原料中占比較大的動(dòng)性微菌屬(Planomicrobium)和Arthrobacter在高溫期兩組實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，見圖4b，表3。

2.5 基于土霉素降解相關(guān)性分析

為了探究溫度、不同微生物類群與土霉素降解之間相關(guān)性，以土霉素處理組為研究樣本，采用Correlation coefficient分析溫度(非生物因素)、微生物類群和土霉素降解之間相關(guān)系數(shù)(表4)，從表中我們可以發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)和Chelatococcus與土霉素降解之間表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，隨后是溫度(非生物因素)、水微菌屬、假黃色單胞菌屬及Thermobacillus等，而動(dòng)性微菌屬、Arthrobacter和Luteimonas表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖4(a) 屬水平上主要微生物類群(相對(duì)豐度>1%);(b) 土霉素處理組中主要變化微生物類群Fig.4(a) Major microbial groups at genus level(relative abundance of >5%);(b)Major microbial groups in oxytetracycline treated group

表3 屬水平上主要差別細(xì)菌屬Table 3 The major microbial difference at genus level

表4 溫度以及不同微生物類群與土霉素降解之間相關(guān)性Table 4 Correlations between temperature,different microbial groups and terramycin degradation

3 討 論

Wang等[19]在研究糞便及土壤中土霉素降解中，通過繪制一級(jí)動(dòng)力學(xué)降解曲線證明，隨溫度的升高，土霉素降解速率加快，整個(gè)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)最高溫度為45 ℃。本研究發(fā)現(xiàn)，牛糞堆肥過程中，最高溫度達(dá)到50℃以上，而且堆肥高溫期土霉素降解速率最大，因此，堆肥所產(chǎn)生的高溫可能會(huì)加速土霉素的降解。Arikan等[14]在研究堆肥過程中土霉素降解時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)熱降解是土霉素降解的關(guān)鍵因素。在本研究中，通過分析溫度、不同微生物類群與土霉素降解之間相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬及Chelatococcus等細(xì)菌屬對(duì)土霉素降解過程具有較大的響應(yīng)，說明土霉素在熱降解的同時(shí)，微生物驅(qū)動(dòng)的生物降解也可能表現(xiàn)出較強(qiáng)的作用，這可能是堆肥過程中土霉素降解的另一個(gè)關(guān)鍵因素。

通過系統(tǒng)分析堆肥過程中微生物變化，發(fā)現(xiàn)土霉素污染下抑制了變形菌門的生長(zhǎng)，厚壁菌門則表現(xiàn)出較強(qiáng)耐受性，更具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。孔維棟[27]通過DGGE研究土培條件下土霉素對(duì)于土壤微生物的影響中發(fā)現(xiàn)，在土霉素組中微生物類群主要為變形菌門、放線菌門以及厚壁菌門等。整個(gè)堆肥過程CK組中變形菌門豐度相對(duì)變化不大，而土霉素處理組中厚壁菌門的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)隨堆肥進(jìn)行而增強(qiáng)，到堆肥后期變?yōu)榈谝粌?yōu)勢(shì)菌群，說明厚壁菌門可能對(duì)土霉素更具有耐受性。

本研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、肉食桿菌屬(Carnobacterium)及假黃色單胞菌屬等在高土霉素脅迫下表現(xiàn)出較高豐度，而在空白組中這些微生物豐度較低，這可能是由于這些微生物能夠利用土霉素等進(jìn)行自身的增殖。徐蓮[20]和王志強(qiáng)[21]分別富集培養(yǎng)到可降解土霉素的菌株，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬。在以不同土霉素底物濃度探究芽孢桿菌屬對(duì)土霉素降解能力中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬最高可降解200 mg·L-1土霉素[21]。在堆肥過程實(shí)際應(yīng)用中，同樣有研究證明，添加芽孢桿菌生物復(fù)合劑可以促進(jìn)堆肥過程中四環(huán)素類抗生素的降解[28]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。而且，我們發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌對(duì)土霉素的降解作用要高于溫度，同樣證明了土霉素的生物降解在堆肥過程中起到了重要的作用。Selvam等[16]在利用DGGE研究堆肥對(duì)不同獸用抗生素的降解中同樣在高溫期檢測(cè)到芽孢桿菌屬和假黃色單胞菌屬等，其中假黃色單胞菌屬在高溫期DGGE條帶顏色變淺，而本研究中其相對(duì)豐度升高。這可能是由于整個(gè)堆肥過程中土霉素抑制了某些優(yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)，而假黃色單胞菌屬在總OTUs下降的環(huán)境下，其相對(duì)豐度上升。于浩[29]同樣通過微生物富集培養(yǎng)的方法，在畜禽糞便污染的土壤中分離得到土霉素降解菌類芽孢桿菌屬，在本研究中高溫期同樣檢測(cè)到高相對(duì)豐度的類芽孢桿菌屬(4.25%)，而在添加土霉素的正常堆肥中，其相對(duì)豐度僅為0.03%。Thermobacillus屬嗜熱菌，在本研究中主要存在于高溫期。王桂珍[30]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬和Thermobacillus對(duì)降解土霉素具有促進(jìn)作用。成潔等[22]同樣發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和無色菌屬(Achromobacter)可以降解土霉素，在本研究中無色菌屬在高土霉素條件下，其相對(duì)豐度較低，在空白與處理實(shí)驗(yàn)中均低于0.2%，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)堆肥處于高溫期，說明高溫不利于無色菌屬的生長(zhǎng)。在土霉素污染脅迫下變形菌門整體豐度下降而假黃色單胞菌屬、水微菌屬和Chelatococcus卻呈現(xiàn)豐度的短暫上升，可能是潛在的土霉素降解菌。Xu等[31]和Sugawara等[32]均發(fā)現(xiàn)水微菌屬可以有效地降解多氯聯(lián)苯等污染物，同樣有研究發(fā)現(xiàn)假黃色單胞菌屬中Pseudoxanthomonasspadix BD-a59[33]、Pseudoxanthomonassp.DMVP2[34]、Pseudoxanthomonassp.R-28[35]分別可以降解苯系物、菲等污染物以及纖維素等農(nóng)業(yè)廢棄物，而Chelatococcus尚沒有報(bào)道與抗生素或污染物降解有關(guān)。盡管如此假黃色單胞菌屬、水微菌屬和Chelatococcus是否能夠降解土霉素仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

(1)堆肥可以有效的降解畜禽糞便中的土霉素，微生物驅(qū)動(dòng)的土霉素生物降解是堆肥過程中土霉素降解一個(gè)關(guān)鍵因素。

(2)在土霉素脅迫下，堆肥過程中所含總體OTUs數(shù)目下降，變形菌門相對(duì)豐度下降，而厚壁菌門相對(duì)豐度上升。Bacillus和Paenibacillus可以作為土霉素降解菌在堆肥過程中對(duì)土霉素的降解起到作用，假黃色單胞菌屬、水微菌屬和Chelatococcus可能是潛在的土霉素降解菌，但仍需進(jìn)一步研究。

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