江興華 崔龍萍 張小蘭 陳麗萍 阮鷺靜 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

豬圓環(huán)病毒病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)影響性疾病，也是我國養(yǎng)豬業(yè)的三大疾病之一，與豬瘟和豬藍(lán)耳病并稱我國養(yǎng)豬業(yè)的三座大山[1]。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）可引發(fā)斷乳后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬繁殖障礙、母豬流產(chǎn)死亡綜合征、育肥豬的慢性呼吸道病綜合征和豬皮炎和腎病綜合征等多種疾病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前為止，疫苗免疫仍是控制PVC2感染引起相關(guān)疾病的重要手段，在疫苗的研制中，病毒抗原含量對免疫效果影響較大，由于PVC2在細(xì)胞中不產(chǎn)生細(xì)胞病變，體外增殖能力差，增殖滴度不高[3]。傳統(tǒng)的生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒的方法是使用轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用微載體生物反應(yīng)器技術(shù)培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒可大大提高抗原效價。

微載體系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自1967年被用于動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),使動物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入高密度培養(yǎng)階段,經(jīng)過幾十年的發(fā)展,該技術(shù)已日漸完善和成熟,正逐漸取代轉(zhuǎn)瓶的生產(chǎn)模式[4]，為了提高微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的抗原效價，本試驗旨在對微載體生物反應(yīng)器接種細(xì)胞時使用不同的接種密度培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型進(jìn)行研究，觀察不同組的貼壁情況、不同時間的細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞增長情況，對比最終收獲的抗原效價，從而選擇微載體生物反應(yīng)器的細(xì)胞最佳接種密度培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒，提高抗原效價，提高豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 試驗用微載體、干粉培養(yǎng)基 微載體型號Cytodex1，購自美國GE公司；干粉培養(yǎng)基MEM購自Gibco公司。

1.2 試驗用細(xì)胞與種毒 PK15細(xì)胞，PCV2種毒（DBN~SX07株）均由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供，PCV2種毒效價為106.5TCID50/mL。

1.3 試驗設(shè)備 微載體生物反應(yīng)器購自廣州齊志工程設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡購自上海光學(xué)儀器五廠；熒光顯微鏡購自日本尼康光學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微載體、生物反應(yīng)器的準(zhǔn)備、滅菌、無檢 稱取4份10 g微載體，分別裝在4個已硅化好的玻璃瓶中，各加600 mL PBS浸泡、過夜，然后棄去PBS，再加入新鮮PBS漂洗3次，最后一次留下適當(dāng)體積的PBS，將4個裝有漂洗過的微載體的玻璃瓶進(jìn)行121℃、30 min高壓滅菌，備用。準(zhǔn)備4臺相同型號的生物反應(yīng)器與相應(yīng)的瓶子與管道，分別校正4臺生物反應(yīng)器的pH電極與DO電極，然后組裝好4臺生物反應(yīng)器及相應(yīng)瓶子與管道，裝上溫度電極，進(jìn)行氣密性檢驗，合格后將組裝好的生物反應(yīng)器121℃、30 min高壓滅菌。滅菌后將反應(yīng)罐連接好，開啟反應(yīng)器，分別加入滅菌后的微載體各1瓶，然后加入500 mL細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行預(yù)熱培養(yǎng)，觀察無菌情況，確保無菌后備用。

1.4.2 轉(zhuǎn)瓶PK15細(xì)胞的消化 取10瓶15 L瓶培養(yǎng)狀態(tài)良好的單層PK15轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞，用PBS洗2次，加0.25%胰酶進(jìn)行消化，消化中止后每瓶加400~500 mL營養(yǎng)液，然后將細(xì)胞瓶用力旋轉(zhuǎn)搖甩，然后將10瓶消化后的細(xì)胞混合成一個轉(zhuǎn)瓶并搖勻，細(xì)胞搖勻后取少量細(xì)胞樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.4.3 接種前細(xì)胞計數(shù) 將轉(zhuǎn)瓶消化下來的細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液按4~5倍的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，將稀釋后的細(xì)胞液加入細(xì)胞計數(shù)板中，在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，并根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果與稀釋倍數(shù)，換算轉(zhuǎn)瓶消化后的細(xì)胞密度。

1.4.4 細(xì)胞接種上罐 分別將4臺生物反應(yīng)器進(jìn)行編號，分別編為 A、B、C、D，四組生物反應(yīng)器細(xì)胞接種密度分別按每個微載體20、30、40、50個細(xì)胞，并計算出每組反應(yīng)器所需的細(xì)胞總數(shù)，將消化后的細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞密度與不同組反應(yīng)器所需的細(xì)胞總數(shù)，計算出每組反應(yīng)器所需要的細(xì)胞體積，每克微載體的數(shù)量為4.3×106個，然后根據(jù)每組反應(yīng)器需要的細(xì)胞體積，將轉(zhuǎn)瓶消化后混合的細(xì)胞分裝成相應(yīng)的4瓶細(xì)胞，然后將4瓶細(xì)胞均加入60 mL種毒（接毒量為培養(yǎng)體積的3%），加入反應(yīng)器罐中，用營養(yǎng)液補足至2 L。

1.4.5 細(xì)胞上罐后培養(yǎng)與取樣觀察 細(xì)胞上罐后設(shè)置好培養(yǎng)參數(shù)，如pH、DO、溫度、攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)，開啟培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至4 h分別進(jìn)行取樣，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況與細(xì)胞狀態(tài)。培養(yǎng)至24 h棄去每罐的培養(yǎng)液，重新加入新鮮的含2%血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24 h換液前、培養(yǎng)48 h、培養(yǎng)72 h時進(jìn)行取樣留樣，在顯微鏡下觀察不同時間細(xì)胞的生長情況與細(xì)胞狀態(tài)，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.4.6 微載體上的細(xì)胞計數(shù) 分別從4組留樣中各取1 mL含微載體的樣至1.5 mL的EP管中，靜置，等微載體沉淀后將上清液吸出，加入1 mL結(jié)晶紫，搖勻后置37℃培養(yǎng)箱中，30 min后充分震搖，培養(yǎng)至60 min時取出，充分震搖，然后按適當(dāng)稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，將稀釋后的樣吸出少量加至細(xì)胞計數(shù)板中進(jìn)行計數(shù)。

1.4.7 抗原收獲與留樣 當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至72 h，每6 h觀察一次反應(yīng)器PID曲線，并取樣觀察細(xì)胞脫落情況，當(dāng)細(xì)胞脫落達(dá)70%時，將反應(yīng)器的轉(zhuǎn)數(shù)提高至150 r/min，攪拌5 min，然后靜置3 min，通過管道收取反應(yīng)器內(nèi)的上清液，將每組反應(yīng)器收獲的抗原分別取2 mL樣用于檢測抗原效價。

1.4.8 抗原效價的檢測 用間接免疫熒光法測定病毒效價，將4組反應(yīng)器培養(yǎng)的抗原樣品，分別用剛消化好的測毒用細(xì)胞懸液進(jìn)行10倍系列稀釋，每組均取10-4、10-5、10-6三個稀釋度稀釋后的病毒細(xì)胞液，分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度加6孔，100 μL/孔，同時設(shè)立陽性對照與陰性對照。培養(yǎng)24 h后換含3 mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 培養(yǎng)至48 h時進(jìn)行細(xì)胞固定、加一抗與二抗孵育，然后在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞對照孔應(yīng)無熒光物質(zhì)著染，而有綠色熒光物質(zhì)著染的細(xì)胞孔判為PCV2感染陽性。統(tǒng)計各組每個稀釋度病毒接種細(xì)胞孔中PCV2陽性孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒TCID50，即抗原效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞貼壁4 h后的貼壁率與細(xì)胞狀態(tài) 從表1數(shù)據(jù)可知，B組與C組按每個微載體30、40個細(xì)胞量上罐的細(xì)胞貼壁率較高，而且細(xì)胞狀態(tài)較好，貼壁率可達(dá)90%以上，而A組與D組按每個微載體20、50個細(xì)胞量上罐的細(xì)胞貼壁率較低，同時細(xì)胞狀態(tài)也較差。

表1 各組反應(yīng)器4 h的貼壁率與細(xì)胞狀態(tài)

2.2 各組反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的細(xì)胞狀態(tài)與細(xì)胞增長情況 從表2數(shù)據(jù)可知，四組反應(yīng)器培養(yǎng)至24~48 h的細(xì)胞狀態(tài)較好，至72 h后細(xì)胞狀態(tài)開始變差，同時四組反應(yīng)器細(xì)胞在貼壁后開始增長，24 h增長倍數(shù)不高，培養(yǎng)48 h后增長倍數(shù)最高，72 h后細(xì)胞增長倍數(shù)開始下降，各時間段整體細(xì)胞狀態(tài)最好的是B組與C組，A組與D組的細(xì)胞狀態(tài)相對較差，在四組中各時間段細(xì)胞增長倍數(shù)最高的是C組，其次是B組，增長倍數(shù)最低的是A組。

2.3 收獲時間與最終抗原效價情況 從表3數(shù)據(jù)可知，C組收獲時的培養(yǎng)時間最長，達(dá)112 h，同時收獲的抗原效價也最高，達(dá)到107.5TCID50/mL，其次是B組，A組與D組收獲時的培養(yǎng)時間相對較短，同時收獲的抗原效價也相對較低，A組的效價最低，只達(dá)106.5TCID50/mL。

表3 不同組反應(yīng)器的收獲時間與最終抗原效價

3 討 論

1）生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)具有如下優(yōu)點：微載體的表面積與體積比增大，可在有限的空間里提供大量表面積，從而獲得密度較高的基質(zhì)細(xì)胞；另外，采用該培養(yǎng)技術(shù)可自動化監(jiān)控細(xì)胞的生長情況，有效減少人力、物力、財力，能夠降低污染，尤其適合大規(guī)模批量生產(chǎn)[5]。由于生物反應(yīng)器培養(yǎng)相對轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有較大的優(yōu)勢，所以，近幾年越來越多的疫苗企業(yè)開始研究生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒工藝并應(yīng)用于大生產(chǎn)，生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒是生物制品行業(yè)未來的發(fā)展趨勢。

2）影響生物反應(yīng)器生產(chǎn)的抗原效價因素很多，如細(xì)胞接種密度、接毒量、培養(yǎng)液pH、溶氧、溫度、收獲時間等，本課題組在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度是影響抗原效價的一個重要因素，本試驗針對生物反應(yīng)器的細(xì)胞接種密度進(jìn)行了研究。

3）許多研究表明，細(xì)胞生長的最終密度分別與細(xì)胞的接種密度和微載體濃度有關(guān)[6]。本試驗表明細(xì)胞接種密度太低，細(xì)胞貼壁不均，貼壁率低，細(xì)胞增殖緩慢，生產(chǎn)的抗原效價低；細(xì)胞接種密度過大，同樣造成細(xì)胞貼壁不均，細(xì)胞增長不高，生產(chǎn)的抗原效價不高。章孟學(xué)等[7]研究也表明，細(xì)胞密度過大，可能會造成病毒吸附不均勻，導(dǎo)致病毒復(fù)制不均。

4）疫苗的抗原效價是決定成品免疫效果的一項重要因素，要提高疫苗免疫效果，提高產(chǎn)品銷量，打造產(chǎn)品的品牌，可利用生物反應(yīng)器來培養(yǎng)病毒，優(yōu)化反應(yīng)器培養(yǎng)工藝來提高抗原的效價，提高免疫效果。

影響抗原效價的因素很多，本試驗研究了反應(yīng)器細(xì)胞的接種密度，對于反應(yīng)器的接毒量、溶氧等其他因素還有待進(jìn)一步研究。

表2 各組反應(yīng)器培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后的細(xì)胞狀態(tài)與細(xì)胞增長情況

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