班艷娜,甄乾娜,傅惠佳

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖健康與不孕癥?？?重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,重慶 400016)

生物硫醇物如同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、半胱氨酸(cysteine,Cys) 和半胱氨酸甘氨酸(cysteinylglycine,CysGly)等廣泛分布于人體內(nèi)的細(xì)胞和血漿中，可通過氧化還原反應(yīng)在硫化物的生物轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者心血管疾病發(fā)病率比健康人高10～20倍[1]，游離型硫醇物和還原型硫醇物濃度升高是尿毒癥患者的主要危險(xiǎn)因素[2-3]。BALD等[4]建立了反相高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法檢測(cè)血漿中硫醇物水平，該方法以硼氫化鈉為還原劑，用2-氯-1-甲基喹啉四氟化-2-氯-1-甲基喹啉衍生后進(jìn)行檢測(cè),缺點(diǎn)是衍生條件復(fù)雜、流動(dòng)相操作繁瑣。SJOBERG等[5]以7-呋喃-4-磺酸銨鹽(7-fuorobenzofurazan-4-sulfonic acid ammonium salt，SBD-F)為衍生劑建立了HPLC熒光檢測(cè)法，該方法可同時(shí)測(cè)定GSH、Cys、Hcy、CysGly等氨基硫醇物，缺點(diǎn)是衍生時(shí)間較長，且衍生溫度較高，不便于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。故本研究擬建立一種新型快速的、可同時(shí)測(cè)血漿中Hcy、Cys和CysGly的總量及其游離型、還原型濃度的HPLC熒光法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器Hcy、Cys、CysGly、GSH、N-1-苯基-馬來酰亞胺[N-(1-pyrenyl)maleimide,NPM]、三羧基乙基膦[tris-(2-carboxylethyl)-phosphine,TCEP]購自美國Sigma公司，乙腈、甲醇(色譜純)購自美國TEDIA公司，醋酸鈉、醋酸、磷酸等其他試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Millipore凈化裝置(美國Millipore公司)純化所得；HPLC系統(tǒng)(購自美國安捷倫公司)由液相系統(tǒng)、真空脫氣系統(tǒng)(g1322a)、四元泵(g1311a)、手動(dòng)進(jìn)樣器(g1328)和熒光檢測(cè)器(g1321a)組成，數(shù)據(jù)采集和處理采用安捷倫化學(xué)工作站，HIMAC-cf15低溫臺(tái)式離心機(jī)(日立工機(jī)株式會(huì)社)。

1.2方法

1.2.1試劑配置用磷酸鹽緩沖液(25 mmol·L-1，pH 7.4)配置標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，GSH、Cys、Hcy、CysGly濃度分別為12、250、10、30 mmol·L-1，分裝后于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。工作溶液用體積分?jǐn)?shù)70%乙腈稀釋備用。稱取120 mg TCEP 溶于1 mL磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度為100 g·L-1的溶液，置于4 ℃保存。取7.4 mg NPM溶于25 mL乙腈中，其濃度為1 mmol·L-1，于4 ℃下保存?zhèn)溆?。混合血漿是取5份正常人血漿作為基質(zhì)備用。

1.2.2色譜條件采用HypersilC18色譜柱(250.0 mm×4.0 mm，5 μm)和安捷倫Hypersil ODS 預(yù)柱 (4 mm×4 mm,5 μm)，柱溫25 ℃；采用程序可變熒光檢測(cè)器確定最佳發(fā)射波長和最佳激發(fā)波長，檢測(cè)流速：0.5 mL·min-1，流動(dòng)相A：15 mmol·L-1醋酸鈉水溶液，流動(dòng)相B：在300 mL水中加入1 mL乙酸和 1 mL 磷酸，流動(dòng)相C:乙腈。梯度洗脫程序?yàn)椋?.0～1.0 min，B和C體積分?jǐn)?shù)分別為30%和70%；1.0～12.5 min，A、B、C體積分?jǐn)?shù)分別為15%、15%和70%，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)時(shí)間13 min。

1.2.3標(biāo)本預(yù)處理硫醇物總量測(cè)定：取血漿樣品90 μL，加入10 μL TCEP (10 g·L-1)進(jìn)行還原,(37.0 ± 0.3) ℃水浴10 min；在還原后的溶液中緩慢加入400 μL衍生劑NPM (1 mmol·L-1)溶液,同時(shí)漩渦振蕩混勻，室溫衍生15 min后加入10 μL體積分?jǐn)?shù)30%乙酸,然后于4 ℃ 下13 000×g離心 10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣測(cè)定硫醇物總量。游離型硫醇物測(cè)定：采用Millipore YM-30 離心超濾管，2 000×g離心 20 min 獲取超濾液。取超濾液 90 μL，加入10 μL TCEP(1 g·L-1)進(jìn)行還原，(37.0±0.3) ℃水浴10 min；然后再緩慢加入400 μL NPM(100 μmol·L-1)進(jìn)行衍生，漩渦振蕩混勻,室溫衍生15 min后于4 ℃下 13 000×g離心10 min，取20 μL上清液進(jìn)樣測(cè)定游離型硫醇物。還原型硫醇物測(cè)定：取超濾液100 μL直接加入400 μL NPM(50 μmol·L-1)，漩渦振蕩混勻,室溫衍生15 min后于4 ℃下 13 000×g離心10 min,取20 μL上清液進(jìn)樣測(cè)定還原型硫醇物。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和檢測(cè)限配置系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將10 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到90 μL混合血漿中，混合物濃度的測(cè)定按“1.2.3標(biāo)本預(yù)處理”進(jìn)行。以不同濃度的工作液加入到基質(zhì)中后測(cè)得的峰面積減去基質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，不同濃度的工作液為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，得到總量和游離型硫醇物標(biāo)準(zhǔn)曲線。還原型硫醇物用標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成6個(gè)濃度，還原型Hcy濃度梯度為0.005、0.050、0.100、1.000、2.000和4.000 mmol·L-1；還原型GSH濃度梯度為0.1、0.5、2.0、4.0、8.0和 10.0 mmol·L-1；還原型Cys濃度梯度為1.5、5.0、10.0、20.0、30.0和50.0 mmol·L-1；還原型CysGly濃度梯度為0.2、1.0、3.0、6.0、12.0和30.0 mmol·L-1。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，硫醇物的濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比S/N=3時(shí)樣品濃度為最低檢測(cè)限。

1.2.5精密度試驗(yàn)日內(nèi)精密度試驗(yàn)是在1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次同一混合血漿Hcy、GSH、Cys、CysGly總量及其還原型和游離型濃度，計(jì)算5份樣本中4種硫醇物的濃度變異。日間精密度試驗(yàn)是連續(xù)5 d測(cè)定同一混合血漿中Hcy、GSH、Cys、CysGly總量及其還原型和游離型濃度，計(jì)算5份樣本中這4種硫醇物的濃度變異。

1.2.6加樣回收率試驗(yàn)取90 μL混合血漿，加入10 μL不同濃度的Hcy、GSH、Cys、CysGly標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定加入標(biāo)準(zhǔn)溶液前后血漿硫醇物濃度。相對(duì)回收率=(血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度-未加標(biāo)準(zhǔn)液血漿濃度)/加入標(biāo)準(zhǔn)液濃度×100%。

1.2.7實(shí)例應(yīng)用選擇2015年10～11月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液透析中心進(jìn)行血液透析的尿毒癥患者34例，其中男17例，女17例，年齡34～75(58.7±12.8)歲。選擇同期健康體檢者32例，其中男16例，女16例，年齡36～69(55.5±10.3)歲。采集所有受試者清晨空腹靜脈血，置于乙二胺四乙酸二鉀真空管內(nèi)，立即置于冰上，1 h內(nèi)3 000×g離心10 min分離血漿，分成2份，一份用于測(cè)定硫醇物總量，置于-20 ℃冰箱保存；另一份置于Millipore YM-30離心超慮管中2 000×g離心 20 min，用于測(cè)定游離型和還原型硫醇物。游離型與還原型硫醇物應(yīng)立即衍生，并在 24 h 內(nèi)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1波長的選擇通過Agilent LC-1100色譜化學(xué)工作站對(duì)NPM-GSH、NPM-Cys、NPM-Hcy和NPM-CysGly衍生物進(jìn)行熒光光譜掃描，結(jié)果顯示，GSH、Cys、Hcy、CysGly最佳發(fā)射波長為380 nm;GSH的最佳激發(fā)波長為230 nm，其余3種硫醇物的最佳激發(fā)波長均為330 nm。綜合考慮選擇激發(fā)波長330 nm和發(fā)射波長380 nm作為檢測(cè)波長。

2.2色譜圖在本研究色譜條件下血漿中4種硫醇物之間能達(dá)到與基線分離，與內(nèi)源性化合物及TCEP、NPM反應(yīng)的峰分離良好，無干擾峰；見圖1。

A：總的硫醇物；B：游離型硫醇物；C：還原型硫醇物；D：硫醇物標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。

圖1硫醇物的色譜圖

圖1Chromatogramfortheaminothiols

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限結(jié)果見表1?？偭考坝坞x型和還原型GSH、Cys、Hcy、CysGly的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均>0.99。GSH、Cys、Hcy及CysGly總量最低檢測(cè)限分別是1.0、3.0、0.5、1.5 μmol·L-1,還原型GSH、Cys、Hcy、CysGly最低檢測(cè)限分別是0.050、1.000、0.005、0.020 μmol·L-1。

表1GSH、Gys、Hcy、CysGly總量及其游離型和還原型濃度檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)限

Tab.1Standardcurvesandminimumdetectionlimitsoftotal,freeandreducedGSH,Cys,HcyandCysGly

檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)線性范圍 /(μmol·L-1)最低檢測(cè)限/(μmol·L-1)GSHy=52.1x+37.30.999 02.00～80.001.000Cysy=62.6x+1 356.00.999 810.00～1 500.003.000Hcyy=121.9x-73.70.999 91.00～120.000.500CysGlyy=87.2x+179.00.999 53.00～240.001.500還原型GSHy=22.9x+1.50.999 30.10～8.000.050還原型Cysy=37.7x+11.00.999 61.30～50.001.000還原型Hcyy=152.1x-0.50.999 20.01～4.000.005還原型CysGlyy=144.7x-0.80.999 30.05～6.000.020

2.4精密度和回收率結(jié)果見表2。測(cè)得樣本回收率在80.1%～111.7%。日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(ralative standard deviation，RSD)均小于5%，日間精密度RSD均小于10%。

表2GSH、Cys、Hcy和CysGly的回收試驗(yàn)和精密度

Tab.2RecoveriesandprecisionofGSH,Cys,HcyandCysGlyinplasma

檢測(cè)物質(zhì)加入量/(μmol·L-1)精密度回收率/%RSD/%日內(nèi)日間GSH4.03.81±0.0997.04.018.1310.09.12±1.0189.11.495.0720.021.06±1.07109.12.317.78Cys100.082.67±2.2380.21.314.41250.0264.10±2.17104.30.422.57500.0538.10±3.66109.21.714.76Hcy1.51.36±0.5988.14.868.0915.014.96±0.3599.03.764.1560.066.42±3.87115.24.484.98CysGly6.05.45±4.4395.44.225.7930.029.86±0.1099.34.154.4760.070.05±3.10115.14.514.37

2.5臨床應(yīng)用結(jié)果見表3。該方法成功應(yīng)用于34例尿毒癥患者和32例健康人血漿中GSH、Cys、Hcy和CysGly的總量及其游離型和還原型濃度的測(cè)定。

表3尿毒癥患者和健康人血漿中GSH、Cys、Hcy和CysGly總量、還原型和游離型的濃度

Tab.3Thetotal，freeandreducedconcentrationsofGSH,Cys,HcyandCysGlyinplasmaofurimicpatientsandheathypeople

檢測(cè)物質(zhì)尿毒癥患者(n=34)健康者(n=32)GSH總量/(μmol·L-1)6.03±2.367.94±1.58游離型GSH/(μmol·L-1)2.11±1.485.92±1.18還原型GSH/(μmol·L-1)0.41±0.340.69±0.30Cys總量/(μmol·L-1)548.00±106.00221.00±49.00游離型Cys/(μmol·L-1)118.00±41.0042.00±12.00還原型Cys/(μmol·L-1)4.63±2.362.60±0.96Hcy總量/(μmol·L-1)36.80±15.3014.40±9.10游離型Hcy/(μmol·L-1)9.12±5.082.16±1.01還原型Hcy/(μmol·L-1)0.08±0.050.05±0.02CysGly總量/(μmol·L-1)31.30±10.5020.90±6.00游離型CysGly/(μmol·L-1)8.89±5.2210.52±3.44還原型CysGly/(μmol·L-1)0.12±0.060.07±0.04

3 討論

Hcy是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，是導(dǎo)致心血管疾病的危險(xiǎn)因子，GSH、Cys、Hcy和CysGly是細(xì)胞還原能力的來源，在機(jī)體的生物代謝中起著重要的作用。當(dāng)細(xì)胞功能受損時(shí)，GSH、Cys、Hcy和CysGly代謝會(huì)發(fā)生紊亂，生物體液中濃度會(huì)顯著改變，同時(shí)檢測(cè)這些硫醇物總的血漿濃度對(duì)疾病診斷、治療以及評(píng)估機(jī)體的氧化還原狀況具有重要意義[3-5]。

目前，測(cè)定血漿硫醇物的常見方法主要是HPLC[6-10],其中柱前衍生HPLC熒光檢測(cè)是檢測(cè)血漿中GSH、Cys、Hcy及CysGly總量最常用的方法。NOLIN等[8]以SBD-F為衍生劑同時(shí)測(cè)定了GSH、Cys、Hcy和CysGly的總量，其缺點(diǎn)是樣品預(yù)處理方法復(fù)雜，衍生時(shí)間為1 h，溫度60 ℃，不便于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。BENKOVA等[9]合成了一種新的衍生劑，僅用于測(cè)定血漿中GSH、Cys和Hcy的總量，該方法簡單、快速、靈敏度高，最低檢測(cè)限達(dá)1.2 pmol·L-1，但是色譜分離時(shí)易受大量的熒光雜質(zhì)干擾。FERIN等[10]采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了血漿中GSH、Cys、Hcy、CysGly的總量，該方法靈敏度高，最低檢測(cè)限為0.01 μmol·L-1，但是衍生溫度高達(dá)60 ℃，不宜臨床常規(guī)檢測(cè)。由于目前常用的檢測(cè)硫醇物方法衍生條件均存在衍生溫度高、時(shí)間長以及未能同時(shí)滿足總量、游離型和還原型硫醇物的精確定量等缺陷，本研究采用HPLC熒光檢測(cè)，以NPM為衍生劑，TCEP為還原劑，建立了一種簡單測(cè)定血漿中各種硫醇物的總量、游離型和還原型濃度的方法。

血漿硫醇物大多以蛋白復(fù)合物形式存在，所以測(cè)定血漿中各種形式的硫醇物需在樣品衍生前進(jìn)行還原處理。TCEP作為還原劑，具有穩(wěn)定、能溶于水、受反應(yīng)時(shí)間、溫度和濃度影響小等優(yōu)點(diǎn)，較采用其他還原劑重復(fù)性好，在4 ℃可穩(wěn)定1周[11]，更適合臨床常規(guī)分析。NPM是巰基的特異性衍生劑，衍生反應(yīng)在常溫10 min內(nèi)即可完成，產(chǎn)生的熒光效率高且穩(wěn)定，色譜圖背景干凈，色譜峰形良好，是一種理想的硫醇物熒光衍生劑[12]。該方法衍生條件簡單、快速，靈敏度高，最低檢測(cè)限達(dá)0.005 μmol·L-1，并成功運(yùn)用于尿毒癥患者透析前及健康人血漿中硫醇物的檢測(cè)。

綜上所述，本研究將NPM作為衍生劑，利用HPLC-熒光法，建立了一種新的可同時(shí)測(cè)定血漿中GSH、Cys、Hcy和CysGly的總量及其還原型和游離型濃度的方法。該方法具有衍生條件簡單、衍生后靈敏度高的特點(diǎn)，并成功應(yīng)用于尿毒癥患者和健康人血漿中硫醇物濃度的快速測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1] YEH J K,CHEN C C,HSIEH M J,etal.Impact of homocysteine level on long-term cardiovascular outcomes in patients after coronary artery stenting[J].JAtherosclerThromb,2017,24(7):696-705.

[2] AUSTEN S K,COOMBES J S,FASSETT R G.Homocysteine and cardiovascular disease in renal disease[J].Nephrology,2003,8(6):285-295.

[3] PRZEMYSLAW W,PIOTR K,GRAZYNA C,etal.Total,free,and protein-bound thiols in plasma of peritoneal dialysis and predialysis patients[J].IntUrolNephrol,2011,43(4):1201-1209.

[4] BALD E,CHWATKO G,GLOWACKI R,etal.Analysis of plasma thiols by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection[J].JChromatogrA,2004,1032(1/2):109-115.

[5] SJOBERG B,ANDERSTAM B,SULIMAN M,etal.Plasma reduced homocysteine and other aminothiol concentrations in patients with CKD[J].AmJKidneyDis,2006,47(1):60-71.

[6] 楊濤，沈高.高效液相熒光法同時(shí)測(cè)定人血漿中4種硫醇物的濃度[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,41(5):679-684.

[7] JUAN G E,MARIA M B,ELISA B G,etal.Determination of reduced homocysteine in human serum by elemental labelling and liquid chromatography with ICP-MS and ESI-MS detection[J].AnalBioanalChem,2015,407(26):7899-7906.

[8] NOLIN T D,MCMENAMIN M E,HIMMELFARB J.Simultaneous determination of total homocysteine,cysteine,cysteinylglycine,and glutathione in human plasma by high-performance liquid chromatography:application to studies of oxidative stress[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2007,852(1/2):554-561.

[9] BENKOVA B,LOZANAV V,IVANOV I P,etal.Determination of plasma aminothiols by high performance liquid chromatography after precolumn derivatization with with N-(2-acridonyl)maleimide[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2008,870(1):103-108.

[10] FERIN R,PAVAO M L,BAPTISTA J.Methodology for a rapid and simultaneous determination of total cysteine,homocysteine,cysteinylglycine and glutathione in plasma by isocratic RP-HPLC[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2012,911:15-20.

[11] PASTORE A,MASSOUD R,MOTTI C,etal.Fully automated assay for total homocysteine,cysteine,cysteinylglycine,glutathione,cysteamine,and 2-mercaptopropionylglycine in plasma and urine[J].ClinChem,1998,44(4):825-832.

[12] RUAN Q,CHEN Y,KONG X,etal.Comparative studies on sulfhydryl determination of soy protein using two aromatic disulfide reagents and two fluorescent reagents[J].JAgricFoodChem,2013,61(11):2661-2668.

[13] NERBASS F B,DRAIBE S A,FEITEN S F,etal.Homocysleine and its determinants in nondialyzed chronic kidney disease patients[J].JAmDietAssoc,2006,106(2):207-270.