石計(jì)朋，栗延偉，郭麗娟，張利利，何曉敬，王衛(wèi)衛(wèi)，郭洪旭，高 俊，郝 潔，黃 倩，唐成和

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院新生兒科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲科，河南 衛(wèi)輝 453100；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100；5.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染疾病科，河南 衛(wèi)輝 453100；6.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

缺氧、感染等多種致病因素均可引起早產(chǎn)兒腦病[1]。既往研究表明，早產(chǎn)兒腦病的主要危險(xiǎn)因素為缺氧和產(chǎn)前感染等[2]，感染后必然會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。ω-6 多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)在臨床中作為靜脈營養(yǎng)脂肪乳劑使用非常廣泛，但有研究表明，此類脂肪乳在感染應(yīng)激狀態(tài)下，可加重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致器官功能損害[4]。本課題組的前期研究結(jié)果表明，ω-3 PUFA能夠降低急性肺損傷大鼠炎性因子分泌，減少細(xì)胞凋亡[5-6]；也有研究發(fā)現(xiàn)，ω-3 PUFA可減少缺氧損傷大鼠腦組織中炎性因子表達(dá)，并降低細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)[7-8]。因此作者推測(cè)，ω-3 PUFA可能會(huì)減輕早產(chǎn)兒感染所致腦損傷中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少腦細(xì)胞凋亡，從而對(duì)腦組織具有保護(hù)作用。本研究使用3日齡新生大鼠模擬人類早產(chǎn)兒，通過注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制作感染所致腦損傷模型，觀察ω-3 PUFA對(duì) LPS所致腦損傷新生大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物和細(xì)胞凋亡的影響，以期為臨床治療早產(chǎn)兒腦損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48只3日齡Sprague Dawley大鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量(18.2±4.3)g；新生大鼠和母鼠均置于25 ℃，濕度約60%的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，光照時(shí)間白天黑夜=12 h12 h；由母鼠喂養(yǎng)新生大鼠，避免過多打擾母鼠及新生大鼠；注意飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生，每天更換水和墊料1次；母鼠進(jìn)食與孕期一致的普通飼料，保證營養(yǎng)均衡、衛(wèi)生，以滿足母鼠和新生大鼠的需求。

1.2主要試劑與儀器LPS(E.coliO111：B4)購自美國Sigma公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，還原型谷胱甘肽(reduced glutathion，GSH)、 氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)活性測(cè)定試劑盒購自美國 Cayman Chemical 公司，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自德國 Roche 公司；Olympus CX21FS1型普通光學(xué)顯微鏡購自日本 Olympus 公司，LKB-V2088型超薄切片機(jī)購自瑞典LKB公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理方法將3日齡新生大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、ω-3 PUFA組和ω-6 PUFA組，每組12只；固定時(shí)間點(diǎn)稱體質(zhì)量并腹腔注射藥物。對(duì)照組大鼠腹腔注射0.6 mL·kg-1生理鹽水后，立即腹腔注射等容積生理鹽水；LPS組、ω-3 PUFA組和ω-6 PUFA組大鼠腹腔注射0.6 mg·kg-1LPS后，分別立即腹腔注射等容積生理鹽水、ω-3 PUFA和ω-6 PUFA[9]。24 h后腹腔注射水合氯醛麻醉各組大鼠，快速斷頭取海馬組織，置于-80 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4各組新生大鼠海馬組織中SOD、MDA、GSH及GSSG水平檢測(cè)取各組大鼠海馬組織，用無菌生理鹽水作為勻漿介質(zhì)，按1 g10 mL在冰浴中充分勻漿制成 100 g·L-1組織勻漿，2 000 r·min-1離心 2 min，取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD水平，改良硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA水平，分別采用GSH、GSSG活性測(cè)定試劑盒測(cè)定GSH和GSSG水平，并計(jì)算GSSG/GSH比值；具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)法檢測(cè)各組新生大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況取各組新生大鼠海馬組織，石蠟包埋后切片，TUNEL法染色后常規(guī)進(jìn)行脫蠟加水，滴加適量蛋白酶 K 工作液，37 ℃ 恒溫箱孵育15 min，隨后滴加標(biāo)記緩沖液，37 ℃ 標(biāo)記 2 h，封閉后滴加生物素化抗地高辛抗體，37 ℃恒溫箱充分反應(yīng)30 min，熒光顯微鏡下用藍(lán)色光激發(fā)觀察，藍(lán)色熒光激發(fā)下，明亮的綠色代表TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞核，提示存在細(xì)胞凋亡。在相同放大倍數(shù)(×200)、光強(qiáng)度下分析讀片，每張切片取3個(gè)視野記錄凋亡細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算AI，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1各組新生大鼠海馬組織中SOD、MDA、GSH、GSSG水平及GSSG/GSH比值比較結(jié)果見表1。與對(duì)照組比較，LPS組、ω-6 PUFA組和 ω-3 PUFA組新生大鼠海馬組織中SOD和GSH水平顯著降低，MDA、GSSG水平及GSSG/GSH比值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LPS組比較，ω-6 PUFA組新生大鼠海馬組織中SOD和GSH水平顯著降低，MDA、GSSG水平及GSSG/GSH比值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ω-3 PUFA 組新生大鼠海馬組織中SOD和GSH水平顯著升高，MDA、GSSG水平及GSSG/GSH比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ω-6 PUFA組比較，ω-3 PUFA組新生大鼠海馬組織中SOD和GSH水平顯著升高，MDA、GSSG水平及GSSG/GSH比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1各組新生大鼠海馬組織中SOD、MDA、GSH、GSSG水平及GSSG/GSH比值比較

組別nSOD/(U·mg-1)MDA/(μmol·g-1)GSH/(mg·g-1)GSSG/(mg·g-1)GSSG/GSH對(duì)照組12114.32±19.2211.56±3.261.45±0.350.028±0.0040.017±0.003LPS組1289.13±15.89a37.74±13.54a0.89±0.21a0.035±0.007a0.037±0.007aω-6 PUFA組1283.28±12.48ab41.25±16.99ab0.79±0.15ab0.038±0.007ab0.048±0.010abω-3 PUFA組1296.65±13.19abc33.68±9.17abc1.02±0.11abc0.032±0.003abc0.032±0.005abcF5.95212.3235.1384.94710.232P0.0020.0000.0040.0040.000

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與LPS組比較bP<0.05；與 ω-6 PUFA組比較cP<0.05。

2.2各組新生大鼠海馬組織AI比較結(jié)果見圖1。對(duì)照組、LPS組、ω-6 PUFA組和 ω-3 PUFA組新生大鼠海馬組織AI分別為(2.35±0.76)%、(2.87±1.14)%、(3.01±1.20)%、(2.77±0.89)%。LPS組、ω-6 PUFA 組和 ω-3 PUFA組新生大鼠海馬組織AI顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ω-6 PUFA組新生大鼠海馬組織AI顯著高于LPS 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ω-3 PUFA組新生大鼠海馬組織AI顯著低于ω-6 PUFA組和LPS 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：LPS組；C：ω-6 PUFA 組；D：ω-3 PUFA。

圖1TUNEL法檢測(cè)各組新生大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況(×200)

Fig.1ApoptosisinhippocampusofneonatalratsineachgroupdetectedbyTUNEL(×200)

3 討論

有研究表明，出生后 3～7 d嚙齒類動(dòng)物發(fā)育水平與人類孕23～36周早產(chǎn)兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育水平接近[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，全身性 LPS 刺激可以導(dǎo)致小鼠腦損傷，在人類早產(chǎn)兒也有類似的情況出現(xiàn)[11]。采用3日齡新生大鼠腹腔內(nèi)注射 LPS(0.6 mg·kg-1)可成功制作感染致腦損傷模型[12]。早產(chǎn)兒生后暴露于全身性感染可導(dǎo)致新生兒腦損傷[13-14]。炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量的氧自由基也參與了腦損傷的形成[15]。在內(nèi)毒素的激活下，巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞生成過多的活性氧，可引起體內(nèi)抗氧化能力下降，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增多，氧化還原平衡被打亂[16-17]。早產(chǎn)兒大腦發(fā)育不成熟，機(jī)體抗氧化能力有限，抗氧化酶活性相對(duì)偏低，因此，更容易出現(xiàn)氧化還原失衡[18-19]。SOD、GSH 是清除體內(nèi)自由基的重要物質(zhì)，SOD、GSH水平代表了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)狀態(tài)。MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，由機(jī)體內(nèi)PUFA在自由基作用下產(chǎn)生，可作為評(píng)估氧化損傷嚴(yán)重程度的間接指標(biāo)[20-22]。GSH在氧化劑作用下通過谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶被氧化成GSSG，GSSG/GSH比值可作為機(jī)體氧化/抗氧化系統(tǒng)是否失衡的間接評(píng)價(jià)指標(biāo)。

ω-3 PUFA的主要成分是二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)[23]，DHA可直接透過血腦屏障進(jìn)入腦細(xì)胞。研究表明，DHA 對(duì)新生大鼠缺氧缺血性損傷可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[24-25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組新生大鼠海馬組織中SOD、GSH水平較對(duì)照組顯著降低，MDA、GSSG水平GSSG/GSH比值較對(duì)照組顯著升高，證明腦損傷新生大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)增加；ω-3 PUFA組新生大鼠海馬組織中SOD、GSH水平高于LPS組和ω-6 PUFA組，MDA、GSSG水平及GSSG/GSH比值低于LPS組和ω-6 PUFA組，使機(jī)體氧化還原系統(tǒng)失衡的程度降低，故可減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物對(duì)腦組織的損害；與LPS組比較，ω-6 PUFA組新生大鼠海馬組織中SOD和GSH水平顯著降低，MDA、GSSG、GSSG/GSH比值顯著升高，提示ω-6 PUFA組新生大鼠體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡較為嚴(yán)重。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有高氧耗、高代謝、抗氧化防御弱等特點(diǎn)，易受到活性氧作用而出現(xiàn)早期氧化應(yīng)激反應(yīng)，大量活性氧可導(dǎo)致機(jī)體氧化還原平衡紊亂，最終出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。未發(fā)育成熟的大腦更容易受到氧化應(yīng)激的損傷，細(xì)胞凋亡大量增加[24-25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組、ω-6 PUFA組和ω-3 PUFA組新生大鼠海馬組織AI顯著高于對(duì)照組；ω-3 PUFA組新生大鼠海馬組織AI顯著低于ω-6 PUFA組和LPS組；說明ω-3 PUFA可明顯抑制海馬組織細(xì)胞凋亡，且變化趨勢(shì)與其降低氧化應(yīng)激反應(yīng)的趨勢(shì)一致，提示 ω-3 PUFA可能通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)而減少細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，ω-3 PUFA可降低LPS所致腦損傷新生大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡水平，但ω-3 PUFA是通過哪些信號(hào)通路調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，尚需進(jìn)一步探討。

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