彭建新 何軍明 蔡炳勤 陳桂豪 劉明

[摘要] 目的 探討中藥扶正抑瘤湯對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響。 方法 扶正抑瘤湯復合方劑經(jīng)提取和提純后處理肝癌細胞，采用MTT法檢測肝癌細胞的增殖能力，劃痕實驗檢測肝癌細胞的遷移能力，Transwell實驗檢測肝癌細胞的侵襲能力。 結果 MTT結果顯示，在肝癌細胞HepG2、MHC97-H中，扶正抑瘤湯400 mg/mL組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；劃痕實驗證明在肝癌細胞MHC97-H中，扶正抑瘤湯400 mg/mL組肝癌細胞遷移速度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；Transwell實驗證明，在肝癌細胞MHC97-H中，扶正抑瘤湯400 mg/mL組侵襲的肝癌細胞數(shù)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 扶正抑瘤湯能抑制肝癌細胞增殖及侵襲轉移能力。

[關鍵詞] 肝癌；扶正抑瘤湯；增殖；侵襲轉移

[中圖分類號] R273.372 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（a）-0025-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Fuzheng Yiliu Decoction on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells （HCC）. Methods Hepatocellular carcinoma cells were treated by Fuzheng Yiliu Decoction. MTT assay was used to detect the proliferation of hepatocellular carcinoma cells. The migration ability of HCC cells was detected by scratch test， while the invasion ability of HCC cells was detected by Transwell assay. Results MTT results showed that in HCC lines HepG2， MHC97-H， the proliferation ability of 400 mg/mL Fuzheng Yiliu Decoction group was significantly lower than the control group （P < 0.05）. Scratch test demonstrated that in liver cancer cell MHC97-H， the migration rate of liver cancer cells in Fuzheng Yiliu Decoction 400 mg/mL group was significantly lower than that in the control group （P < 0.05）. Transwell experiment proved that in liver cancer cell MHC97-H， the number of invading hepatoma cells in the 400 mg/mL Fuzheng Yiliu Decoction group was significantly lower than that in the control group （P < 0.05）. Conclusion Fuzheng Yiliu Decoction can inhibit the proliferation， invasion and metastasis of HCC.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Fuzheng Yiliu Decoction； Proliferation； Invasion and metastasis

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）由于起病隱匿，60%～80%的患者發(fā)現(xiàn)時均處于疾病晚期[1]，大量HCC患者因腫瘤轉移而喪失手術機會，盡管近年來肝癌的手術切除率已明顯提高，然而HCC手術切除5年遠處轉移率高達80%[2]，局部熱消融治療3年遠處轉移率高達61%[3-4]，肝移植術后5年遠處轉移率高達65%[5]。有關HCC的侵襲轉移因素及機制的研究是當前的熱點。既往研究提示HCC侵襲轉移可能與腫瘤血管高密度表達[6]、MAPK通路的激活[7]、細胞基質金屬蛋白（MMP）高表達[8]等有關，但具體機制尚未明確，因此探索與HCC侵襲轉移相關機制及其治療意義重大。近年來隨著原發(fā)性肝癌的中醫(yī)體質、病因病機、診斷、辨證分型、治療等研究的迅速發(fā)展[9]，中醫(yī)藥在防治肝癌的過程中發(fā)揮著日益巨大的作用，中西醫(yī)結合也成為目前診治肝癌的最佳途徑[10]。扶正抑瘤湯是通過隨著扶正培本辯證施治選用的抑氣養(yǎng)陰中藥，臨床中取得一定療效，但具體機制未明。本實驗擬通過體外實驗探討扶正抑瘤法對肝癌細胞的增殖以及侵襲轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株和細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2、MHC97-H購自中科院上海細胞庫，采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2 藥物的組成和提取

三棱10 g、莪術15 g、龍葵15 g、白英10 g、半枝蓮30 g、白花蛇舌草30 g、黃芪9 g、當歸、茯苓 30 g、白術10 g。將中藥包按質量1∶15進行水提，水浴鍋60℃超聲浸泡80 min，共3次。過濾、合并濾液，減壓濃縮至浸膏，浸膏得率為33.3%。

1.3 藥物處理

以5×106/L的密度分別將HepG2、MHC97-H接種于75 mL細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶6 mL。細胞貼壁后，分別加入新鮮配制的扶正抑瘤湯和PBS。為觀察腫瘤細胞對藥物的劑量依賴性，以終濃度為50、100、200、400 mg/mL的扶正抑瘤湯作用細胞，培養(yǎng)72 h時更換培養(yǎng)液及藥物。

1.4 細胞增殖檢測

對數(shù)生長期細胞，調整細胞密度為103～104個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后按照分組加入含藥培養(yǎng)基，設置4個濃度（50、100、200、400 mg/mL）和對照組（只加培養(yǎng)液），每組設置4個復孔。置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔吸去20 μL上清，加20 μL MTT，在培養(yǎng)箱中溫育4 h后，吸凈上清，每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度A值。

1.5 劃痕實驗

在6孔板背側橫穿過孔均勻劃5條橫線。將經(jīng)400 mg/mL扶正抑瘤湯處理96 h后的MHC97-H細胞以5×105個/孔的密度接種6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)12 h使之貼壁，換無血清培養(yǎng)基饑餓12 h。用200 μL槍頭垂直皿底橫線做劃痕，用PBS清洗3遍以棄掉漂浮的細胞。于0、24 h拍照，測量各個時間點細胞遷移距離。每組實驗重復3次。

1.6 Transwell實驗

經(jīng)400 mg/mL扶正抑瘤湯處理96 h后的MHC97-H細胞以8×105個/孔種入6孔板中，向鋪有Matrigel的Transwell小室上室中加入上細胞懸液，在下室中加入600 μL無血清NIH3T3細胞培養(yǎng)液上清，于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室用棉簽小心擦去上室內層未穿過膜的細胞，以95%乙醇固定20 min，PBS洗滌3次，進行HE染色。在顯微鏡下觀察計數(shù)穿過Matrigel和膜的細胞數(shù)（40×，鏡下10野/室）。對比分析各組細胞的侵襲能力。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 扶正抑瘤方對肝癌細胞增殖的影響

結果顯示：在肝癌細胞HepG2、MHC97-H中，扶正抑瘤湯400 mg/mL組的OD值明顯低于無藥物處理的對照組（P < 0.05），提示其對肝癌細胞的增殖有明顯抑制作用。見表1。

2.2 扶正抑瘤方對肝癌細胞MHC97-H遷移能力的影響

結果顯示，對照組和扶正抑瘤湯400 mg/mL組24 h后劃痕寬度差分別為（6.5±1.2）比（17.3±4.4）mm，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示扶正抑瘤湯對肝癌細胞有遷移能力有明顯的抑制作用（圖1）。

2.3 扶正抑瘤方對肝癌細胞MHC97-H侵襲能力的影響

結果顯示，對照組和扶正抑瘤湯400 mg/mL組穿膜細胞數(shù)分別為（135±12）、（53±6）個，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示扶正抑瘤湯對肝癌細胞侵襲能力有明顯的抑制作用（圖2）。

3 討論

肝癌屬于中醫(yī)“積聚”“脅痛”“黃疸”“鼓脹”等疾病范疇，盡管對于肝癌的病因病機各類學說紛呈，但基本達成共識，認為肝癌為本虛標實之證，本虛即脾氣不足，正氣虧損[11]。標實指邪毒內蘊，氣血瘀滯，痰濕蘊結[12]。應用傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療肝癌經(jīng)驗尤為寶貴，各家在治則治法上又有不同，總結起來包括：①以益氣健脾的治療原則?！耙姼沃?，知肝傳脾，當先實脾”為中醫(yī)之古訓，錢伯文認為即使是在熱毒壅盛或濕濁內聚而應用清熱解毒或化濕利濕等法時，也不忽視扶正的一面[13]。于爾辛則認為肝癌辨證，重在脾胃。②調理氣機為主導的治療方法。肝主疏泄，調人體一身之氣機，脾乃中土，為氣機升降之樞紐，故治肝癌調理氣機為先。于爾辛則強調疏肝與理氣的差異，而尤重理氣，常用木香、枳實等。劉嘉湘主張肝癌疏通氣血、條達為要，不管疾病處于何階段始終貫徹疏通氣血之法，喜用八月札、柴胡、綠萼梅、青皮之類[14]。③消導為主的治療手段。于爾辛創(chuàng)立了以健脾理氣佐以消導的加味四君子湯[15]。

嶺南瘍科流派代表性傳承人名老中醫(yī)蔡炳勤教授認為：“祛邪為匡正，邪去更扶正”，外科手術、化療、放療等方法可謂驅邪的一種手段，而對腫瘤患者的整個治療過程，必須采用持續(xù)性扶正，間斷性驅邪。在此指導下，通過多年臨床實踐，筆者發(fā)現(xiàn)肝癌患者多為體虛氣弱，久病耗氣，外加現(xiàn)代醫(yī)學常用的手術、化療、放療等方法使其精血進一步耗傷，元氣受損，常表現(xiàn)為面削形瘦、神疲乏力等正氣虧虛之證，同時正虛邪盛，又可導致腫瘤進一步擴散和復發(fā)，從而加重病情。因此，針對肝癌患者正氣虧虛、氣血不足、痰瘀互阻、聚而成瘤的這種虛實夾雜的復雜證候，筆者確立以扶正抑瘤法組方來治療肝癌[16]。扶正抑瘤湯藥物包括“扶正”“抑瘤”兩個方面。“扶正”采用能夠改善機體內環(huán)境、增強免疫功能、提高自身抗腫瘤免疫能力的藥物，如黃芪、當歸、茯苓、白術，這些藥物性味甘平，均有補益氣血、健脾扶正、調理臟腑功能的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學的研究提示，黃芪中的黃芪總皂苷能明顯改善肝癌患者的免疫功能[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，茯苓中羊毛甾烷三萜類化合物與抗癌藥物合用，能促進小鼠巨噬細胞產(chǎn)生集落刺激因子，明顯促進粒細胞增殖，引起造血細胞再生，這表明茯苓可提高放、化療的療效[18]?！耙至觥眲t采用對腫瘤細胞有殺傷作用的中藥，如半枝蓮、白花蛇舌草、三棱、莪術、龍葵、白英，這些藥物性味苦寒，有利濕消腫、清熱解毒、軟堅散結、抑瘤消癥的功效。有研究報道，以黃芪、當歸、莪術、墓頭回為主要的扶正抑瘤顆粒含藥血清可通過改變小鼠肝癌細胞H22細胞內鈣離子濃度誘導細胞發(fā)生凋亡[18]。臨床上杜建教授以扶正抑瘤法結合中醫(yī)辨證配伍治療消化系統(tǒng)腫瘤，可以有效緩解腫瘤術后放化療的副作用，改善患者的癥狀，從而提高患者的生存質量[19]。筆者臨床工作中亦運用扶正抑瘤的方法對肝癌患者術后進行辯證施治，該方對預防肝癌患者術后復發(fā)轉移取得了滿意的臨床療效，但以現(xiàn)代醫(yī)學的方法探討扶正抑瘤湯對肝癌的侵襲轉移具體機制還有待進一步研究。

侵襲、轉移性是肝癌惡性生物學行為的重要特征，雖然手術治療仍是目前提高肝癌治療效果的主要手段，然而僅少數(shù)較早期肝癌患者適合手術治療，大部分患者因腫瘤的轉移而喪失了手術機會。即使接受手術治療，術后發(fā)生轉移及復發(fā)的概率也非常高，5年無瘤生存率僅26%左右[20]。大多數(shù)肝癌患者并非死于原發(fā)性癌而是死于轉移性癌。因此，探索能夠抑制肝癌侵襲、轉移的治療方法有重要意義。在前期臨床使用扶正抑瘤湯對肝癌患者術后治療有一定臨床效果的基礎上，本研究先通過MTT檢測扶正抑瘤湯處理后肝癌細胞增殖能力的變化，結果發(fā)現(xiàn)扶正抑瘤湯處理組肝癌細胞的OD值較對照組有明顯差別，且OD值與藥物的濃度之間有一定的負相關性，提示扶正抑瘤湯能明顯抑制肝癌細胞的增殖能力。進一步采用劃痕實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)扶正抑瘤湯處理后肝癌細胞MHC97-H的遷移能力和侵襲能力較對照組均明顯降低，表明扶正抑瘤湯對肝癌細胞的侵襲遷移能力有一定的抑制作用。

綜上所述，以“扶正培本、抑瘤散結”為治法的扶正抑瘤湯能夠抑制肝癌細胞的增殖，進一步的研究發(fā)現(xiàn)其能抑制肝癌細胞的侵襲轉移能力。雖然其具體機制尚未明確，但為扶正抑瘤方有效降低臨床肝癌患者術后的復發(fā)和轉移提供了理論依據(jù)，也為臨床合理的用藥提供了科學依據(jù)。

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