孔令廣 董 會 王慶佶 劉靈芝

山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院 山東泰安 271018

植物病原菌種資源庫是植物病理學實驗課程的重要教學載體，是實踐教學的基礎，也是理論聯(lián)系實際的重要橋梁[1]。病原菌資源的種類多少和質(zhì)量的好壞直接影響著植物病理學實驗教學的效果[2]。菌種庫成為制約實驗教學改革、發(fā)展的瓶頸。建立具一定規(guī)模的植物病原菌種資源庫對進一步深化本科教學改革，加強教學實踐環(huán)節(jié)，全面提高教學質(zhì)量起到至關(guān)重要的作用，是每位實驗教學教師應該認真考慮和著手開展的工作[3]。

隨著“互聯(lián)網(wǎng)+”和分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，植物病理學研究進入一個新的時代[4]。目前，越來越多的高校根據(jù)學科發(fā)展需要，在本科階段安排了分子植物病理學相關(guān)實驗，如植物病原菌基因組的提取，通過核酸序列鑒定植物病原菌的種類，植物病原菌的遺傳轉(zhuǎn)化等，這些實驗安排既便于操作，又能體現(xiàn)分子植物病理學的創(chuàng)新內(nèi)涵，使得學生能通過實驗教學及時地理解并掌握分子植物病理學發(fā)展的前沿理論知識[5]。為適應新的實驗教學內(nèi)容，新構(gòu)建植物病原菌基因組庫，為分子生物實驗教學提供素材，推動實驗內(nèi)容的教學改革。

1 植物病原菌種資源庫的整體布局

目前，山東農(nóng)業(yè)大學植物保護實驗教學中心(以下簡稱“實驗中心”)正在積極構(gòu)建自己的病原菌中資源庫，主要從圖1所示的幾方面進行。

圖1 植物病原菌種資源庫的構(gòu)建示意圖

2 植物病原菌種資源庫的具體內(nèi)容

2.1 病原菌種庫構(gòu)建

立足本省，放眼全國，對山東省及國內(nèi)主要植物病害的病原菌進行分離培養(yǎng)和鑒定、保存。植物病原真菌獲得采用組織分離法[6]，獲得的菌株通過顯微鏡檢或分子生物學技術(shù)鑒定、命名，并用無菌水在4 ℃冰箱保存或者在適宜的固體斜面培養(yǎng)基低溫保存。植物病原細菌采用劃線法和稀釋法獲得單一菌落，通過革蘭氏染色或分子生物學技術(shù)鑒定、命名，常用50%甘油和菌液 1:1 混合，混勻后-80 ℃冰箱中保存[7]。實驗中，每位學生分離一種固定病害，檢驗學生對本節(jié)實驗技能掌握情況。同時，還要求每位學生根據(jù)自己興趣愛好，額外選擇一種病害進行分離培養(yǎng)，這樣既增加菌種數(shù)量，也大大開拓了學生的眼界，豐富了實驗內(nèi)容。中心除了自己分離病原菌外，還可與其他院校開展病原菌種交流活動，互換南北各地特色菌株，來豐富和完善現(xiàn)有的植物病原菌種。

2.2 菌落形態(tài)圖庫構(gòu)建

利用高清數(shù)碼相機將上述分離培養(yǎng)的病原菌的菌落的形態(tài)、顏色、菌絲的密集和稀疏等特點進行拍攝，菌落特征的文字描述增加相應的圖片庫，圖文并茂，填補實驗中心病原菌菌落形態(tài)圖庫的空白，使枯燥的文字描述，變得生動形象，便于學生理解和掌握。新構(gòu)建的菌落圖庫為將來學生獨立開展病原菌鑒定具有重要的指導意義。例如，學生在分離果樹病害時，就可以通過菌落形態(tài)和顏色進行初步鑒定：蘋果樹的腐爛病原菌在PDA培養(yǎng)基上，初期為白色，后期為褐色，正面氣生菌絲減少，而且會產(chǎn)生多個子實體。而蘋果樹輪紋病菌在PDA培養(yǎng)基上，初期為白色濃密的絨毛菌絲，然后菌落顏色逐漸從中心點向四周變成青色，最后變成墨綠色，而且黑暗條件下，不易形成分生孢子器。通過這些典型的病原菌菌落特征，學生就可以對分離的微生物進行快速初步鑒定，大大提高了實驗效率。另外，教師也通過積累獲得完全具有自己知識產(chǎn)權(quán)菌落圖片，可用于實驗教學及出版各類教材。

2.3 玻片標本庫構(gòu)建

將分離的病原菌制作成結(jié)構(gòu)典型、完整清晰的切片。選取植物病害的典型病，如霉狀物(草莓灰霉病等)、粉狀物(玉米瘤黑粉)、霜狀物(黃瓜霜霉病等)、銹狀物(小麥葉銹病等)、顆粒狀物(蘋果炭疽病等)等，在實驗室可采用“挑、撕、刮、貼、切”等方法將病原菌結(jié)構(gòu)制成臨時玻片。質(zhì)量好的典型結(jié)構(gòu)的需經(jīng)固定、染色、脫色等步驟制成永久玻片。目前，實驗中心已保存常見植物病害玻片300余種，2000多片，并按病原菌或寄主命名，便于教師和學生查看，豐富了實驗教學資源。

2.4 數(shù)字切片庫構(gòu)建

利用Motic全自動掃描顯微系統(tǒng)將上述玻片掃描成數(shù)字切片，存儲在計算機內(nèi)，按病原菌或寄主命名，便于教師、學生查詢和學習。制作數(shù)字切片時，先命名要掃名的切片和選擇存儲路徑，然后利用Motic全自動掃描顯微系統(tǒng)在4X物鏡下對玻璃切片進行快速掃描獲得掃描地圖，此時，得到的是玻片標本的名稱和目標圖片的大體位置。然后找到所需要的目標后轉(zhuǎn)到高倍物鏡下建模，建模完成后自動掃描，相應的掃描控制軟件將掃描的切片自動進行無縫拼接和處理，存儲并建立數(shù)字切片庫。目前，掃描植物病害玻片300余種，這些病害已按寄主名稱如大田作物、經(jīng)濟作物、果樹、蔬菜、林木、花卉等進行分類，也有的是按病原菌分類如卵菌、接合菌、子囊菌、擔子菌、半知菌，滿足農(nóng)業(yè)病理學實驗和普通植物病理學實驗等課程的不同需求。教師和學生可以隨時登錄山東農(nóng)業(yè)大學植物保護實驗教學中心的數(shù)字切片庫網(wǎng)站進行瀏覽學習，學生“時時學，處處學”變得可行，極大拓寬了學生獲取知識的渠道，鍛煉了學生自主學習的能力。

2.5 病原菌的基因組庫建立

將上述分離純化的病原菌，篩選重要和具有研究價值的病原菌，分別用真菌基因組DNA提取試劑盒(Fungle Genomic DNA Kit)、細菌基因組提取試劑盒(Bacteria Genomic DNA Kit)、病毒RNA提取試劑盒(RNApure Virus Kit)以及RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取病原菌的基因組，具體操作參照各自說明書。最后將提取的基因組DNA或合成的cDNA置于-20 ℃冰箱中，RNA要保存于-80 ℃冰箱。學生通過實驗提高了動手能力，培養(yǎng)了科研能力和創(chuàng)新精神。同時，為開展病原菌的分子鑒定，病原菌致病基因的克隆和功能分析等分子生物學實驗項目提供素材。

3 結(jié)語

病原菌種資源庫的構(gòu)建，有利于培養(yǎng)學生動手能力，訓練其扎實的實驗基本功，為以后獨立開展植物病害的相關(guān)工作奠定了良好的基礎。建立病原菌的基因組庫和信息資源庫符合學?！袄矛F(xiàn)代生物技術(shù)和計算機技術(shù)提升傳統(tǒng)學科”的教學規(guī)劃。菌種資源庫的建立從根本上改變傳統(tǒng)單調(diào)的教學模式，深化了實驗教學改革，合理的配置教學資源，提高了實驗教學質(zhì)量。

[1]楊媚.植物病害標本在教學改革中的地位和作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2014,42(5)1583-1584.

[2]王文龍,呼和巴特爾,楊曉野,王瑞,劉珍蓮,陸靜.獸醫(yī)寄生蟲標本資源庫建設及其在教學中的應用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2013(6):336-337.

[3]梁元存,竺曉平,李壯,張修國,楊廣玲,趙春青,劉玉升.《普通植物病理學》實驗教學改革[J].實驗科學與技術(shù),2014,12(2):149-151.

[4]常有宏,張磊,劉郵洲.植物病原真菌PCR 檢測技術(shù)研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2012,40(2):89-93.

[5]張鉉哲,冉隆賢,李永剛,廖曉蘭,易圖勇,張俊華.植物病理學研究技術(shù)[M].北京:北京大學出版社,2015.

[6]全國高校微課教學比賽.[EB/OL].http://weike.enetedu.com/play.asp?vodid=189184&e=14.

[7]許志剛.普通植物病理學實驗實習指導[M].北京:高等教育出版社,2008:5-9,70-79.