姚曉露，楊明明，高 翔，2，董 劍，趙萬春，張炳慧，王衛(wèi)東，何慶夢

(1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西楊凌 712100； 2.陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)屬于喜涼作物，在生長季內(nèi)熱脅迫會對產(chǎn)量造成影響[1]。據(jù)調(diào)查，未來平均氣溫每升高1 ℃，全球小麥將減產(chǎn)6%，而且溫度的升高會對小麥的一些生理指標產(chǎn)生影響[2]。作為僅次于水稻的第二大糧食作物，小麥減產(chǎn)會增加糧食安全的風險[3]。作為磷脂酶家族重要的成員，磷酸肌醇特異性磷脂酶C(phosphoinositide-specific PLC，簡稱PI-PLC)在植物生長發(fā)育過程中起到重要作用，參與多種環(huán)境脅迫應答[4]。PI-PLC的結構雖然簡單，但在植物中的功能卻復雜多樣。在玉米中， ZmPLC1通過促進細胞的不對稱分裂對植株的發(fā)育進行調(diào)控[5]。在油菜中，過表達 BnPLC2基因可以加速植株生長、提高粒重及油含量[6]。Djafi等[7]發(fā)現(xiàn)PI-PLC抑制劑能夠抑制植酸的合成，而植酸通路在籽粒發(fā)育中非常重要，涉及營養(yǎng)物質(zhì)的運輸。Zhang等[4]對小麥幼苗研究發(fā)現(xiàn)，外源施加PI-PLC的抑制劑U73122和Edelfosinec能夠抑制幼苗生長，并且增強了幼苗對干旱和鹽脅迫的敏感性。Aggarwal等[8-9]發(fā)現(xiàn)用脫落酸(ABA)處理小麥籽粒后， TaPLC1基因以及部分植酸通路基因的表達量顯著增加，由此可知，激素可能參與PI-PLC對植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用。

PI-PLC水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成兩個重要的信號分子肌醇三磷酸(IP3)和甘油二醇(DAG)，進而參與植物的生長發(fā)育[10]。PI-PLC一直被認為是脅迫誘導激活的酶[11]，U73122被認為是專一的PI-PLC抑制劑，廣泛地用于植物PI-PLC的功能研究[12]。熱脅迫時，U73122阻止IP3的積累，IP3影響了Ca2+釋放，而Ca2+參與植物非生物脅迫[如鹽脅迫、干旱脅迫(正)、冷脅迫(負)]的調(diào)控[10,13-15]。已有證據(jù)表明小麥中TaPLC基因參與非生物脅迫的應答反應[16]，影響小麥苗期的抗旱性、耐鹽性和耐冷性[4,17]。在擬南芥中，PI-PLC參與熱脅迫調(diào)節(jié)[18]。本研究選取熱敏感型及耐熱型小麥材料，并用U73122進行處理，分析小麥 TaPLC1基因與耐熱的相關性，以期為解析小麥的耐熱性機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為普通小麥品種中國春和TAM107，中國春為熱敏感型品種，TAM107為耐熱型品種，均由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院品質(zhì)改良實驗室提供。

1.2 材料處理

選取成熟飽滿大小均勻一致的中國春和TAM107種子，首先用75%的酒精消毒1 min，無菌水沖洗3次；隨后用5% NaClO消毒10 min，無菌水沖洗4～5次，于滅菌水中浸泡24 h 后將種子移種到鋪有3層濾紙的培養(yǎng)血上，每皿30粒種子，萌發(fā)前保持濾紙濕潤，待幼苗的根能夠固著在濾紙上后，使用霍格蘭氏營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)溫度為 24 ℃/18 ℃(光照14 h/黑暗10 h)。

處理如下，(1)一葉一心時期，用15 μmol·L-1PI-PLC抑制劑U73122浸泡根部4 h，兩葉一心期在40 ℃條件下進行熱脅迫處理；(2)兩葉一心期在40 ℃條件下進行熱脅迫處理；(3)不進行抑制劑和熱脅迫處理(CK)。各處理均設3個重復，分別在熱脅迫0 min、15 min、30 min、1 h、2 h和4 h 取各處理的幼苗葉片，并迅速放入液氮中速凍，然后于-80 ℃ 冰箱保存。將熱處理4 h的幼苗轉入24 ℃/18 ℃(光照/黑暗)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，觀察記錄幼苗的生長情況。

1.3 生理指標的測定

熱脅迫處理4 h的材料用于測定生理指標。葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，可溶性糖含量采用蒽酮法測定，葉綠素含量采用Arnon法測定，每個樣品設置三個生物學重復[19-20]。用 Excel 2016 和 SPSS 20 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 TaPLC1基因的表達分析

1.4.1 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法從中國春和TAM107正常生長及處理后幼苗的葉中提取RNA，使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設計與qRT-PCR

根據(jù) TaPLC1基因的cDNA序列，利用 Primer Premier 5.0設計實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)引物，正向引物為5′-GGGCACTCGGGTTACTTC-3′，反向引物為5′-GTAGCCACAGCCACCATT-3′。在18S RNA上設計的引物 T-18S-F/R作為內(nèi)參，其正向和反向引物序列分別為5′-GCATTTGCCAAGGAT GTTTTC-3′和5′-TGCTATGTCTGGACCTG GTAAGT-3′。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

以cDNA為模板，用上述合成引物，在QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀上進行 qRT-PCR分析。qRT-PCR反應總體系20 μL：SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，10 μmol·L-1引物各1 μL，cDNA模板 2 μL，滅菌ddH2O加至20 μL。擴增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環(huán)。每個樣品設置3個生物學重復。采用 2-ΔΔCT法[21]分析實驗數(shù)據(jù)，確定基因的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 熱脅迫和PI-PLC抑制劑對小麥苗期生理指標的影響

兩個品種熱脅迫4 h時的葉片生理指標測定結果如表1所示。相對于正常幼苗，熱敏感型品種中國春和耐熱型品種TAM107的葉片在熱脅迫后MDA含量、SOD含量和可溶性糖含量不同程度增加，葉綠素含量下降。熱脅迫下，以單獨熱脅迫幼苗為對照，抑制劑處理后中國春和耐熱型品種TAM107葉片丙二醛含量、SOD含量和可溶性糖含量與對照相比均有不同程度的增加，葉綠素含量不同程度降低。從表1生理指標整體變化趨勢可以看出，熱脅迫下，抑制劑處理后中國春的生理指標相對于TAM107 變化更大。

這些生理指標的變化說明，抑制劑處理后兩品種對熱脅迫均更敏感，PI-PLC抑制劑影響幼苗的耐熱性，對熱敏感型品種影響更大。

2.2 熱脅迫和PI-PLC抑制劑對小麥幼苗表型的影響

兩葉一心期觀察幼苗表型，進行熱脅迫處理，并記錄脅迫前后的變化，結果如圖1所示。處理前幼苗長勢一致、較好，熱脅迫處理4 h時中國春發(fā)生萎蔫，TAM107輕微萎蔫，處理后12 h均恢復正常。一葉一心期進行過抑制劑處理的兩個品種，在熱脅迫處理4 h后的第2天，幼苗葉尖出現(xiàn)輕微枯萎變黃現(xiàn)象，處理后第5天嚴重枯萎，葉片開始卷曲。

2.3 熱脅迫下 TaPLC1基因的表達特性分析

以獲得的RNA為模板進行反轉錄，采用qRT-PCR引物進行熒光定量PCR，測定 TaPLC1基因在兩個品種(中國春和TAM107)兩葉一心期不同熱脅迫處理時間的表達并分析品種之間的差異。由圖2可知，以正常植株的葉片作對照，在熱脅迫過程中，未經(jīng)抑制劑處理的中國春葉片中 TaPLC1基因的表達量先上升，在30 min達到最大值，為起始值的3.3倍，之后開始下降；未經(jīng)抑制劑處理的TAM107葉片中 TaPLC1基因的表達量先上升，在30 min達到最大值，數(shù)值為起始值的14.3倍，之后開始大幅度下降，在1 h達到最小值，數(shù)值為起始值的17%，之后開始上升，在2 h達到起始值的72%，之后再次下降。抑制劑處理后，中國春葉片中 TaPLC1基因的表達量在熱脅迫過程中先下降，15 min之后開始上升，30 min達到最大值，為起始值的2.3倍，之后又下降，整體呈現(xiàn)下降-上升-下降-上升-下降的趨勢；TAM107葉片中 TaPLC1基因的表達量先上升，在30 min達到最大值，為起始值的1.4倍，之后開始下降，2 h達到最小值，為起始值的61%，之后又上升。未經(jīng)抑制劑處理、熱脅迫條件下， TaPLC1基因在兩個品種中的表達均迅速上調(diào)，并在30 min處達到最大值， TaPLC1基因在耐熱型小麥品種TAM107中的表達上調(diào)幅度明顯大于中國春。抑制劑處理后，熱脅迫時 TaPLC1基因在兩個品種中的表達模式不同，耐熱型小麥品種TAM107中的上調(diào)幅度較小，響應熱脅迫的程度不明顯；中國春在熱脅迫15 min內(nèi)未及時響應，但之后迅速響應，在30 min處達到最大值，與未經(jīng)抑制劑處理幼苗變化幅度差異不明顯。

表1 PI-PLC抑制劑處理的幼苗在熱脅迫4 h后的相關生理指標Table 1 Relevant parameters of seedlings treated with PI-PLC inhibitors under heat stress for 4 h

CK：未經(jīng)熱脅迫及抑制劑處理的幼苗；40 ℃：40 ℃熱脅迫處理4 h；U73122：抑制劑U73122處理；同一列數(shù)據(jù)后的不同字母表示處理間在0.05水平上差異顯著。

CK:Seedlings untreated with heat stress and inhibitors; 40 ℃:40 ℃ heat treatment for 4 h;U73122:U73122 inhibitor treatment;Different letters following data in same column indicates significant difference between treatments at 0.05 level.

A：熱脅迫前；B：熱脅迫4 h；C：熱脅迫4 h后的第2天；D：熱脅迫4 h后的第5天。

A:Before heat stress;B:Heat stress for 4 h;C:The second day after heat stress for 4 h;D:The 5th day after heat stress for 4 h.

圖1PI-PLC抑制劑處理后小麥幼苗對熱脅迫的反應

Fig.1ResponseofwheatseedlingstoheatstressaftertreatedwithPI-PLCinhibitors

對比抑制劑處理和未處理幼苗中的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)U73122在一定程度上抑制了幼苗中 TaPLC1基因的表達(圖2)，40 ℃熱脅迫4 h后停止脅迫，未經(jīng)抑制劑處理的幼苗均恢復正常，而 U73122處理的幼苗受到損傷(圖1)，說明 TaPLC1基因表達被抑制后幼苗對熱脅迫的敏感性增加，也說明 TaPLC1可能參與了小麥幼苗的耐熱調(diào)控過程。

A:未經(jīng)抑制劑處理的中國春;B:未經(jīng)抑制劑處理的TAM107;C:經(jīng)抑制劑處理的中國春;D:經(jīng)抑制劑處理的TAM107；CK：未經(jīng)熱脅迫及抑制劑處理的幼苗。

A:Chinese Spring untreated with inhibitor; B:TAM107 untreated with inhibitor; C:Chinese Spring treated with inhibitor; D:TAM107 treated with inhibitor; CK:Seedlings untreated with heat stress and inhibitors.

圖2TaPLC1在40℃熱脅迫下的表達模式

Fig.2ExpressionpatternsofTaPLC1under40℃heatstress

3 討 論

MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，發(fā)生膜脂過氧化作用時[22]，會產(chǎn)生較高含量的MDA[23]。熱脅迫時，熱敏感基因型品種較耐熱型品種MDA含量增加較多[24]。植物體內(nèi)的內(nèi)源保護系統(tǒng)由酶和非酶組成[25]，SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，植物通過自身調(diào)節(jié)機制提高SOD活性以適應熱脅迫，若長時間遭受熱脅迫，SOD活性下降，則會加劇膜脂過氧化作用，引起膜損傷[26]，耐熱型小麥品種的SOD活性較高[27-30]。葉綠素是一類與光合作用有關的重要色素，熱脅迫會加速葉綠素降解，含量下降，在黑麥和小麥中已經(jīng)得到證實[31-33]?？扇苄蕴鞘菨B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脅迫條件下植物的滲透調(diào)節(jié)功能與可溶性糖的積累有關[34]，在逆境下可溶性糖含量升高有利于植物體對抵抗逆境脅迫，從而在一定程度上可增強生物體對環(huán)境脅迫的適應性[26]。本試驗中抑制劑處理后兩種類型小麥品種的葉片MDA含量均顯著升高，說明抑制劑處理后的幼苗葉片發(fā)生了更嚴重的膜脂過氧化作用，而SOD的活性也均顯著升高，說明抑制劑處理后幼苗需要更高的SOD活性來應對熱脅迫；葉綠素含量均顯著下降，在5 d后葉片變黃不再恢復，并且抑制劑處理使小麥需要更多的可溶性糖來抵抗高溫，說明抑制劑處理后小麥的耐熱性下降。以上結果與前人的研究一致。而抑制劑處理后中國春MDA含量、SOD活性以及可溶性糖含量變化幅度均大于TAM107，葉綠素含量則相差不多，說明PI-PLC可能參與了小麥熱脅迫應答反應，并且中國春較TAM107更加敏感。

研究表明，PI-PLC是通過水解產(chǎn)生IP3和DAG來參與植物生長發(fā)育的，熱激使成纖維細胞PI-PLC降解生成IP3[35]，IP3快速上升，而IP3伴隨著Ca2+的增加而增加[36]。熱激誘導人類表皮癌細胞A-431中IP3的水平增加，但U73122阻止熱激引起的IP3增加[37]。本研究表明，小麥受到熱脅迫時 TaPLC1迅速增加以應對熱脅迫，同時U73122處理過的幼苗 TaPLC1增加幅度變小。TAM107中該基因表達增加的幅度明顯變小，可能與其較強的耐熱性有關；而中國春中該基因表達增加的幅度變小不明顯，可能與其熱敏感性有關。抑制劑處理后幼苗的表型，受損比較嚴重，進一步說明了 TaPLC1基因在熱脅迫應答中的重要作用。TAM107的耐熱性較強極有可能與 TaPLC1的高表達有關， TaPLC1基因參與小麥耐熱性的具體機制有待于進一步研究。

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