張 洋劉曉菲王 楠朱 晴韓 笑

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南250014； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，山東濟(jì)南250335）

HER-2陽性乳腺癌是一種原癌基因過度表達(dá)的疾病，具有高趨化、高侵襲、惡性程度高、預(yù)后較差且易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[1]。從中醫(yī)學(xué)角度，HER-2高表達(dá)型乳腺癌患者具備先天不足的病因，其腫瘤細(xì)胞低分化、增殖速度快、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、具有耐藥性等符合正虛毒戀的病機(jī)。臨床使用曲妥珠單抗治療HER-2高表達(dá)型乳腺癌取得較好療效，但成本高且耐藥性增加[2]，遂從中醫(yī)角度探索更好的解決方法。本實(shí)驗采用的陽和化巖湯由《外科證治全生集》“陽和湯”化裁而來，課題組前期檢測到陽和化巖湯在體內(nèi)實(shí)驗的caspase信號上游有PI3K的異?；罨痆3]，故本研究從HER-2介導(dǎo)的PI3K/Akt通路探討陽和化巖湯聯(lián)合曲妥珠對HER-2高表達(dá)乳腺癌的干預(yù)機(jī)制。

1 實(shí)驗材料

1.1 動物及細(xì)胞系來源 乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3（HER-2高表達(dá)型：ERa66-/Era36-PR-/HER2+/EGFR+），中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。出生后6周健康SD雄性大鼠15只，SPF級，體重（230±10）g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供并飼養(yǎng)，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2016-0003，實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2016-0019。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 中藥 陽和化巖湯，按鹿角霜-熟地-莪術(shù)-山慈菇-土貝片3∶2∶2∶2∶2稱取各飲片共50g，按1∶20比例加入95%乙醇溶液回流提取2h，自然冷卻，抽濾，得濾液，56℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以每4g原生藥材用25mL Tyrode緩沖鹽溶液[4]，超聲混勻后得陽和化巖湯供試液，-20℃冰箱保存，使用前置于室溫自然解凍。中藥飲片購于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)藥學(xué)院鑒定后制劑。

1.2.2 腸吸收液 大鼠禁食12h后，脫頸椎處死，剖開腹腔，取出小腸，自回盲瓣以上5cm起向上選取14cm腸段，用Tyrode緩沖液沖洗，硅膠套管軟端插入腸管，絲線結(jié)扎，翻轉(zhuǎn)腸道，暴露黏膜層，Tyrode緩沖液沖洗表面，另一端用絲線結(jié)扎成囊狀，將25mL中藥藥液預(yù)先加入麥?zhǔn)显」?，通入混合氣體（95%O2，5%CO2），37℃恒溫，腸管中注入2mL Tyrode緩沖液后放入麥?zhǔn)显」埽?h后取樣40μL，同時補(bǔ)充等體積Tyrode緩沖液，標(biāo)記后-20℃保存[5]。

1.2.3 供試液 用氮?dú)鈱⑺藐柡突瘞r湯腸吸收液吹干，加入1mL 80%甲醇復(fù)溶，超聲3min，渦旋30s，0.2μm濾膜過濾。腸吸收液混勻后無菌濾膜濾過除菌，將所得樣品分裝于無菌EP管中，-20℃保存待用。實(shí)驗用藥時加入以無血清培養(yǎng)基稀釋的陽和化巖湯腸吸收液125mg/L。

1.2.4 曲妥珠單抗 曲妥珠單抗以完全培養(yǎng)基稀釋，濃度為150μg/mL，上海羅氏制藥有限公司提供。

1.2.5 其他試劑 RPIM1640培養(yǎng)基，M199培養(yǎng)基，青、鏈霉素（Hyclone公司，USA），優(yōu)級胎牛血清（Gibco公司，USA），平衡鹽溶液（Solarbio），蛋白Marker，血管內(nèi)皮生長因子C，抗Maker小鼠抗β-actin抗體，DAB顯色試劑盒、ECL發(fā)光劑、一抗稀釋液、Western及IP細(xì)胞裂解液、蛋白上樣緩沖液（碧云天生物科技有限公司），蛋白酶抑制劑（Merck公司），脫脂奶粉（Sigma），所有引物（上海桑尼生物科技有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（南京凱基生物科技公司）。

1.3主要儀器CO2培 養(yǎng) 箱（美 國Precision公司），冷凍超速離心機(jī)（美國Beckman公司），酶標(biāo)儀（美國Biotek公司），石蠟包埋機(jī)（英國Shandon Histocentre），天能凝膠成像分析系統(tǒng)（深圳天能公司），顯影機(jī)（日本柯達(dá)公司），梯度PCR儀（iCycler型，美國biorad公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

2 實(shí)驗方法

2.1 細(xì)胞分組與培養(yǎng)用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素雙抗的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃、5%C02培養(yǎng)箱中孵育乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞，每24h換液傳代，隨機(jī)選取對數(shù)期生長的乳腺癌細(xì)胞株，分成4組：對照組，中藥組，曲妥珠組，中藥+曲妥珠組。在96孔板中加入細(xì)胞200μL/孔（約2×105個細(xì)胞），于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后加入不同藥物處理細(xì)胞，對照組加入10μL PBS，藥物干預(yù)組分別加入10μL陽和化巖湯腸吸收液、曲妥珠、陽和化巖湯腸吸收液+曲妥珠。

2.2 Western blot法檢測相關(guān)因子蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，各加入200μL預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30min，離心，留取上清液并將其稀釋到50μg/mL，取等量蛋白（70μg/泳道）上樣。電泳條件：濃縮膠恒壓60V約20min，分離膠80V約80min。凝膠電泳結(jié)束后，將分離到的蛋白條帶轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別孵育PTEN、p-Akt、PI3K、VEGFC抗體，4℃過夜。用1×TBST洗滌3次，洗凈未結(jié)合的一抗，孵育二抗室溫1.5h，用1×TBST洗膜，洗去游離二抗，曝光顯影。對膠片進(jìn)行掃描，以目的蛋白質(zhì)條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2.3 半定量RT-PCR法檢測相關(guān)因子mRNA表達(dá) 將500μL Trizol試劑分別加入各組細(xì)胞，提取總RNA，檢驗RNA完整性及純度，當(dāng)OD260/280比值在1.8～2.0時用于試驗。取總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。每個標(biāo)本重復(fù)3遍，以β-actin作為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)所用引物序列見表1。于紫外透射反射分析儀下拍照，采用圖像分析軟件分析各電泳條帶的積分光密度值，各目標(biāo)條帶積分光密度值與內(nèi)參照β-actin光密度值的比值為目標(biāo)基因的相對光表達(dá)量。

表1 引物序列

3 實(shí)驗結(jié)果

3.1 各組相關(guān)因子蛋白表達(dá)比較 見表2。

3.2 各組相關(guān)因子mRNA表達(dá)比較 見表3。

表2 各組相關(guān)因子蛋白表達(dá)比較

表3 各組相關(guān)因子mRNA表達(dá)比較

4 討論

曲妥珠單抗作為一種人源化單克隆抗體對HER-2過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有特異性的靶向治療作用[6]，有研究表明臨床應(yīng)用曲妥珠靶向治療1年內(nèi)發(fā)生耐藥現(xiàn)象，PI3K/Akt通路的持續(xù)激活是導(dǎo)致耐藥的重要原因，因此對于具有耐藥現(xiàn)象的乳腺癌患者，考慮增加中藥治療或許可以提高機(jī)體對曲妥珠的敏感性[7]。

明代陳實(shí)功《外科正宗》記載：“初如豆大，漸若棋……日后腫如覆碗……其時五臟俱衰，四大不救，名曰乳巖?！比閹r形成，以“癌毒”為標(biāo)志，即有形之實(shí)邪搏結(jié)于乳絡(luò)，病因乃“陰極陽衰”，腎陽不足，陰寒內(nèi)生，沖任失調(diào)，復(fù)感六淫之邪或傷于飲食情志，氣機(jī)不暢而致痰凝血瘀，當(dāng)溫補(bǔ)腎陽、調(diào)攝沖任、行氣活血、化痰散結(jié)，故選用溫陽散結(jié)中藥陽和化巖湯。方中君藥鹿角霜與熟地溫補(bǔ)肝腎，填精補(bǔ)髓；土貝化痰散結(jié)、排癰消腫，《本草從新》曰其“治外科痰毒”，莪術(shù)破血行氣、消積止痛，山慈菇解毒化痰散結(jié)，三藥并用溫陽通脈、化痰活血，共為臣藥。全方溫陽與填精并用，祛痰與通絡(luò)相伍，陽虛得補(bǔ)，寒痰凝滯得通。

乙醇作為親水性有機(jī)溶劑，溶解性能好，對中草藥細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)，因此采用乙醇溶液提取中藥成分并制備陽和化巖湯腸吸收液，經(jīng)測定中藥成分包括熟地黃多糖、5-羥甲基糠醛、土貝母皂苷、山慈菇多糖、莪術(shù)醇、β-欖香烯、姜黃素等，采用腸囊外翻技術(shù)，較既往血清藥理實(shí)驗具有含藥量高、干擾成分少、活性顯著等特點(diǎn)[8]。

PTEN為抑癌基因，相關(guān)實(shí)驗將雌鼠PTEN剔除，結(jié)果顯示小鼠乳腺癌發(fā)生概率升高，其機(jī)制與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，除中藥組外其他治療組均能明顯增強(qiáng)PTEN表達(dá)，中藥+曲妥珠組表達(dá)高于中藥組、曲妥珠組，中藥組效果不及曲妥珠組，RT-PCR結(jié)果相似，中藥與曲妥珠聯(lián)用效果優(yōu)于單種用藥，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)PTEN表達(dá)，提示中藥可能對曲妥珠存在輔助作用。

在抑制腫瘤生成的多種途徑中，PI3K/Akt通路發(fā)揮了重要作用。Akt屬于原癌基因，被PI3K和PDK磷酸化，活化產(chǎn)物為p-Akt，可以通過調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)血管生成和遷移等途徑促進(jìn)腫瘤的生長[10]。PTEN可通過調(diào)節(jié)上述通路發(fā)揮其腫瘤抑制作用，使生長因子第二信使PIP3變成PIP2，能夠特異性去除磷脂酞肌醇-3,4,5三磷酸肌醇環(huán)-3位磷酸根，關(guān)閉PI3K/AKT及其下游諸多通路，阻礙細(xì)胞周期向S期過渡，使細(xì)胞在G1期阻滯，抑制腫瘤的生長[11-12]。本實(shí)驗各藥物組均可抑制PI3K、p-Akt表達(dá)，中藥組、曲妥珠組抑制PI3K、p-Akt效果不及中藥+曲妥珠組，曲妥珠+中藥組抑制PI3K/Akt信號通路的活化效果最佳，藥物聯(lián)合使用較單種藥物作用更明顯。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移方式，VEGFC是血管內(nèi)皮生長因子家族中最強(qiáng)的促淋巴管生成因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為及細(xì)胞惡變的發(fā)生。VEGFC在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，與淋巴管密度顯著相關(guān)[13-14]。本研究結(jié)果顯示陽和化巖湯能夠降低VEGFC表達(dá)，效果不及曲妥珠，而中藥與曲妥珠聯(lián)合使用能更好地降低VEGFC的表達(dá)。

本實(shí)驗從PTEN-PI3K/Akt通路方面，重點(diǎn)探討干預(yù)乳腺癌細(xì)胞生成的相關(guān)因子PTEN、PI3K、p-Akt以及與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的VEGFC的表達(dá)，實(shí)驗結(jié)果證明陽和化巖湯腸吸收液聯(lián)合曲妥珠能夠干預(yù)PTENPI3K/Akt通路活化，有效增強(qiáng)PTEN表達(dá)，降低PI3K、p-Akt及VEGFC的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞生成與轉(zhuǎn)移。雖然單純使用中藥效果不及曲妥珠，但中藥與曲妥珠聯(lián)用顯示出更好的治療效果，提示中藥可能存在輔助作用，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗微血管、淋巴管新生和脈管侵襲干預(yù)機(jī)制研究提供借鑒。