曹智雅，耿東升

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院，烏魯木齊　830011；2新疆軍區(qū)藥品儀器檢驗所，烏魯木齊　830063)

一測多評法測定蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分的含量

曹智雅1，耿東升2

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院，烏魯木齊830011；2新疆軍區(qū)藥品儀器檢驗所，烏魯木齊830063)

摘要：目的蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分的一測多評含量測定方法的建立。方法采用高效液相色譜法，色譜柱Inertsil ODS-3(5 μm，4.6mm×250mm)，流速1.0mL/min，檢測波長270 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL流動相為乙腈-0.3%磷酸水，流動相配比為0～15min，乙腈0%～10%；15～45min，乙腈10%～30%；45～60min，乙腈30%～75%；60～70min，乙腈75%～95%；70～80min，乙腈95%～0%。以綠原酸為內(nèi)標(biāo)建立與松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的相對校正因子，計算松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、綠原酸的含量，實現(xiàn)一測多評。同時采用外標(biāo)測定10批蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分的含量，并比較相對校正因子所得計算值與實測值的差異，以驗證一測多評法的準(zhǔn)確性和可行性。結(jié)果蓮?fù)⒓{其顆粒中檢測成分的相對校正因子分別為：f綠/f松=0.445 9，f綠/f蘆=0.4530，f綠/f毛=0.590 5，f綠/f淫=0.812 2。一測多評法的計算值與外標(biāo)法所得的實測值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分的含量分別為綠原酸0.60mg/g、松果菊苷11.37mg/g、蘆丁0.79mg/g、毛蕊花糖苷2.17mg/g、淫羊藿苷 0.77mg/g。結(jié)論一測多評法操作簡便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為蓮?fù)⒓{其顆粒的定量分析方法。

關(guān)鍵詞：蓮?fù)⒓{其顆粒；含量測定；一測多評法；相對校正因子

中圖分類號：R914

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2018)05-0619-06

當(dāng)下，珠航局正在全力構(gòu)造珠江水運的“四梁八柱”，通過建設(shè)“干支銜接區(qū)域成網(wǎng)的高等級航道體系、江海聯(lián)動功能互補(bǔ)的港口服務(wù)體系、功能完善優(yōu)質(zhì)高效的現(xiàn)代航運體系、生態(tài)優(yōu)先示范帶動的綠色發(fā)展體系、職責(zé)清晰保障有力的安全預(yù)控體系、協(xié)調(diào)有力運轉(zhuǎn)有效的水運治理體系”6大體系，推動珠江水運實現(xiàn)“一流的設(shè)施、一流的技術(shù)、一流的管理、一流的服務(wù)”發(fā)展目標(biāo)，為交通強(qiáng)國建設(shè)助力。

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.022

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目(201191257)

作者簡介：曹智雅(1993-)，女，在讀碩士，研究方向：藥物分析。

通信作者：耿東升，男，碩士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥品監(jiān)督與藥理學(xué)，E-mail：dongsheng811@sina.com。

本文引用：曹智雅，耿東升.一測多評法測定蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分的含量[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2018,41(5):619-624.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.022

SimultaneousdeterminationoffivecomponentsinLianweianaqigranulesbyquantitativeanalysismulti-componentssinglemarker

CAOZhiya1，GENGDongsheng2

(1SchoolofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2InstituteforDrugandInstrumentControlofXinjiangMilitaryCommand,Urumqi830063,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for Simultaneous determination of five components of Lianweianaqi granules.MethodsThe relative correction factors(RCF)of echinacoside,rutin,acteoside and icariin were established by high performance liquid chromatography with chlorogenic acid as internal standard.The chromatographic conditions are Chromatographic column Inertsil ODS-3(5 μm,4.6mm×250mm),1 ml/minflow rate,270 nm detection wavelength,30℃column temperature,mobile phase is acetonitrile -0.3% phosphoric acid water,flow matching ratio is 0-15min,0%-10% acetonitrile;15-45min,10%-30% acetonitrile;45-60min,30%-75% acetonitrile;60-70min,75%-95% acetonitrile;70-80min,95%-0% acetonitrile.The RCF was used to calculate the content of echinacoside,rutin,acteoside,icariin and chlorogenic acid,to achieve quantitative analysis multi-components single marker(QAMS).At the same time,the external reference method was used to determine the amounts of the five components in the powder of 10 batches of Lianweianaqi granules,to compare the difference between the calculated and real data of the two method,and to validate the correctness and adaptability of QAMS.ResultsThe RCF for the detectable components in the granules were:f綠/f松=0.445 9，f綠/f蘆=0.4530，f綠/f毛=0.590 5，f綠/f淫=0.812 2.There was no significant difference between the calculated and real data of the two method(P<0.05).The 5 components were chlorogenic acid 0.60mg/g,echinacoside 11.37mg/g,rutin 0.79mg/g,acutin 2.17mg/g and icariin 0.77mg/g.ConclusionThe QAMS is simple and reliable,and it can be used as the quantitative analysis method of the preparation.

Keywords:Lianweianaqi granules;determination of content;quantitative analysis multi-components single marker;relative correction factor

一測多評法(quantitative analysis multi-components single marker，QAMS)是利用中藥有效成分之間的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系，通過測定1個成分(對照品易于得到)實現(xiàn)對多個成分(對照品難得到或供應(yīng))的同步測定，是一種適合中藥特點的多指標(biāo)質(zhì)量評價模式[1]。2015年版《中國藥典》中已收錄了多種中藥及其制劑的一測多評方法[2]。蓮?fù)⒓{其顆粒由雪蓮、肉蓯蓉、桑椹、阿那其根、骨碎補(bǔ)、威靈仙、土鱉蟲、仙靈脾、等12味中藥組成，具有補(bǔ)腎通絡(luò)、活血化瘀、祛風(fēng)止痛等功效，臨床上多用于治療退行性關(guān)節(jié)炎[3]，方中以雪蓮、肉蓯蓉、桑椹合為君藥，主要成分為蘆丁、綠原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷等[4-7]；以阿那其根、骨碎補(bǔ)、鹿銜草、土鱉蟲、仙靈脾合為臣藥，主要成分為蘆丁、綠原酸、淫羊藿苷等[8-10]。本研究以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，采用一測多評法建立蓮?fù)⒓{其顆粒中綠原酸與松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的相對校正因子，以相對校正因子計算4種成分含量，并將一測多評法與外標(biāo)法進(jìn)行比較，確定一測多評法測定蓮?fù)⒓{其顆粒中有效成分的可靠性，現(xiàn)報道如下。

1　材料

1.1儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)，R-200D型電子天平(德國Sartorius公司)，AKHL-Ⅲ-16型艾柯超純水機(jī)(四川成都康寧實驗專用純水設(shè)備廠)，KQ52B型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器股份有限公司)。

1.2試藥蘆丁(中國食品藥品檢定研究院，批號100080-201409，純度92.6%)，綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201415，純度96.2%)，松果菊苷(中國食品藥品檢定研究院，批號111670-201505，純度92.5%)，毛蕊花糖苷(中國食品藥品檢定研究院，批號111530-201309，純度92.9%)，淫羊藿苷(中國食品藥品檢定研究院，批號110737-201516，純度94.2%)，乙腈(美國SIGMA公司，色譜純)，水為超純水，其他試劑均為分析純。10個批次的蓮?fù)⒓{其顆粒為新疆軍區(qū)藥品儀器檢驗所實驗室自制。

2　方法與結(jié)果

2.1蓮?fù)⒓{其顆粒的制備將雪蓮、肉蓯蓉等5味藥材經(jīng)70%乙醇提取，干燥后得到的醇提浸膏干粉；將阿那其根、桑椹等藥材經(jīng)水提取干燥后所得的粗多糖干粉與經(jīng)滅菌的骨碎補(bǔ)和土鱉蟲細(xì)粉混勻，分別加入稀釋劑和助懸劑(藥粉重量10%的微晶纖維素細(xì)粉和0.5%羧甲基纖維素鈉)，以70%乙醇為潤濕劑制粒，60℃干燥整粒后再混入白術(shù)揮發(fā)油-β環(huán)糊精包合物細(xì)粉，制得符合藥典規(guī)定的顆粒劑。

2.2溶液的制備方法

2.2.1對照品溶液的制備稱取綠原酸、松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇配置成濃度分別為6.12、101.60、6.92、33.60、16.16μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備稱取蓮?fù)⒓{其顆粒0.1 g，置10mL容量瓶中，加入70%乙醇，超聲提取30min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性供試品溶液的制備按處方比例配置缺雪蓮、肉蓯蓉、雪蓮、鹿銜草和仙靈脾的陰性顆粒，按“2.2.2”項下方法制備，即得陰性對照溶液。

2.3色譜條件Inertsil ODS-3色譜柱(5 μm，4.6mm×250mm)；流動相：乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，柱溫30℃；檢測波長270 nm；流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL，洗脫程序見表1，見色譜圖1～6。

表1　梯度洗脫程序

(1：綠原酸；2：松果菊苷；3：蘆丁；4：毛蕊花糖苷；5：淫羊藿苷)

(1：綠原酸；2：松果菊苷；3：蘆??；4：毛蕊花糖苷；5：淫羊藿苷)

(1：綠原酸；2：松果菊苷；3：蘆??；4：毛蕊花糖苷；5：淫羊藿苷)

2.4方法學(xué)考察

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液1、2、5、10、15μL，按“2.3”項下色譜條件測定，以對照品的進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各成分在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2　蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線和范圍

2.4.2精密度試驗取同1份蓮?fù)⒓{其顆粒供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定綠原酸、松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面積，計算得 RSD分別為0.9%、1.4%、1.9%、1.9%、2.0%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3重復(fù)性試驗取同一批號的蓮?fù)⒓{其顆粒0.1 g，平行6份，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定綠原酸、松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷化學(xué)成分的含量，RSD分別為1.0%、1.8%、1.6%、2.3%、1.5%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗取同1份蓮?fù)⒓{其顆粒供試品溶液10μL，按“2.3”項下色譜條件，分別于配置后的0、2、4、8、12、24h測定峰面積積分值，綠原酸、松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷內(nèi)峰面積的RSD分別為1.2%、1.0%、1.8%、1.3%、1.3%，表明在24h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.4.5加樣回收率試驗取已知含量的同一批次樣品約0.1 g，平行6份，加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，計算各成分的加樣回收率及RSD，見表3。

表3　蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分加樣回收率結(jié)果

2.5相對校正因子的確定

2.5.1相對校正因子的測定取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件，分別進(jìn)樣1、2、5、10、15μL進(jìn)行測定。選擇綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)相對校正因子的計算公式[11]：fk/m=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)其中AK為內(nèi)標(biāo)物峰面積，WK為內(nèi)標(biāo)物濃度為，Am為其他組分峰面積，Wm為其他組分濃度，分別計算內(nèi)標(biāo)物綠原酸與松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷之間的RCF，見表4。

2.5.2校正因子耐用性考察取“2.2.1”項下制備的混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別進(jìn)樣1、2、5、10、15μL測定，計算各成分相對校正因子，考察Agilent 1100、Shimadzu LC-20A 高效液相色譜儀，Inertsil ODS-3(5 μm，4.6mm×250mm)、XBridgeTMC18(5 μm，4.6mm×250mm)、Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6mm×250mm)，3種不同色譜柱對綠原酸相對校正因子的影響，結(jié)果RSD值均<5.0%，表明在不同高效液相色譜儀和色譜柱對RCF無影響，見表5。

表4　蓮?fù)⒓{其顆粒的相對校正因子

2.5.3待測組分色譜峰定位考察相對保留值(rk/s)、相對時間差(ΔtR(k))2種參數(shù)在2種不同儀器和3種不同色譜柱的重現(xiàn)性。各成分相對保留值按公式rk/s=tR(k)/tR(s)計算，其中tR(k)為指標(biāo)成分的保留時間，tR(s)為內(nèi)標(biāo)的保留時間。各成分的相對時間差按公式ΔtR(k/s)=tR(k)-tR(s)計算，其中tR(k)為指標(biāo)成分保留時間，tR(s)為內(nèi)標(biāo)的保留時間。結(jié)果各待測成分相對保留值RSD均小于5%，相對保留時間差RSD值均>6%，見表6。

表5　蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分相對校正因子耐用性的考察結(jié)果

表6　蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分的相對保留值和相對時間差測定結(jié)果

2.5.4一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較分別采用一測多評法與外標(biāo)法對10批蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分色譜峰進(jìn)行定位并計算含量。為確定一測多評法的準(zhǔn)確性，本實驗利用2種方法進(jìn)行考察：(1)相關(guān)系數(shù)考察法[12]：將2種方法結(jié)果經(jīng)相關(guān)系數(shù)分析，二者之間的相關(guān)系數(shù)均>0.999 9，說明2種方法得到的含量相似性極高。將計算結(jié)果經(jīng)t檢驗，P>0.05，說明2種方法得到的計算結(jié)果無差異。(2)相似度評價法[13]：借鑒指紋圖譜相似度評價方法，通過計算夾角余弦值來評價外標(biāo)法與一測多評法所得結(jié)果的相似度，從而考察兩者的差異程度。根據(jù)夾角余弦的統(tǒng)計學(xué)定義，2組數(shù)據(jù)的夾角余弦值越接近1，其兩者差異越小，相似度越高。將2種方法得到的數(shù)據(jù)計算夾角余弦值，結(jié)果均在0.989～0.999，表明其相似度極高?？梢娨粶y多評法在蓮?fù)⒓{其顆粒的質(zhì)量評價中應(yīng)用是可行的，見表7。

表7　一測多評法與外標(biāo)法對蓮?fù)⒓{其顆粒中5種成分測定結(jié)果/(mg/g，n=10)

注：A：外標(biāo)法；B：一測多評法。

3　討論

3.1樣品處理方法的優(yōu)化為使顆粒中成分提取完全，本研究選用了不同濃度的甲醇、乙醇、水作為溶劑進(jìn)行提取，并考察超聲和回流2種提取方法的效果。結(jié)果顆粒中黃酮類成分和苯乙醇苷類成分均溶于乙醇，以70%乙醇超聲法提取，所得圖譜分離度較好，雜質(zhì)峰較少，方法簡單，成本較低。

3.2色譜條件的優(yōu)化綠原酸為苯丙素類化合物，分子結(jié)構(gòu)中含脂鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)中鄰二酚羥基極易被氧化，受熱、見光都能使其喪失生物活性，而在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定；同時其他成分中也含有酚羥基呈弱酸性，酸性緩沖體系可改善含弱酸性酚羥基類的分離效果和峰型[14-15]。本研究考察了甲醇-水、乙腈-水，加入甲酸、磷酸、乙酸等流動相系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-0.3%磷酸水流動相系統(tǒng)的分離效果最優(yōu)，分離度、理論塔板數(shù)、出峰數(shù)目、出峰時間均達(dá)到滿意結(jié)果。

[收稿日期：2017-09-16]

(本文編輯施洋)