阿仙姑·哈斯木,努爾滿(mǎn)古力·肉孜,2，徐麗秀，哈提拉·吐?tīng)栠d，馬俊旗

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，烏魯木齊　830011；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊　830000；3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，烏魯木齊　830054)

專(zhuān)題研究

作者簡(jiǎn)介：阿仙姑·哈斯木，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：宮頸癌病因、發(fā)病機(jī)制研究。兼任中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤病因?qū)W學(xué)會(huì)青年委員、中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)青年委員、新疆醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)專(zhuān)業(yè)委員、新疆免疫學(xué)學(xué)會(huì)理事。入選新疆維吾爾自治區(qū)法醫(yī)病理專(zhuān)家?guī)?。?dān)任《Plos One》、《Molecular Biology Reports》、《新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》等期刊審稿人。以通信作者及第一作者身份發(fā)表論文30余篇，包括SCI收錄論文20篇。先后主持科研課題共10項(xiàng)(包括國(guó)家自然科學(xué)基金3項(xiàng)、中國(guó)科學(xué)院西部之光科學(xué)基金1項(xiàng)、新疆維吾爾自治區(qū)課題2項(xiàng)、新疆國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室面上項(xiàng)目1項(xiàng)等)。作為主要貢獻(xiàn)者，獲得各級(jí)科技成果獎(jiǎng)共4項(xiàng)，包括2017年度新疆維吾爾自治區(qū)科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)1項(xiàng)(排名第一)、2015年度新疆醫(yī)學(xué)科技獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)1項(xiàng)(排名第三)、2013年度新疆維吾爾自治區(qū)科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)1項(xiàng)(排名第一)、發(fā)表的學(xué)術(shù)論文分別獲得2014年和2013年自治區(qū)優(yōu)秀科技論文一等獎(jiǎng)和二等獎(jiǎng)，2014年度新疆維吾爾自治區(qū)科協(xié)新疆轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)青年杰出貢獻(xiàn)三等獎(jiǎng)1項(xiàng)(排名第一)。先后獲得新疆維吾爾自治區(qū)人民政府第七屆新疆青年科技獎(jiǎng)(2014年)、新疆醫(yī)科大學(xué)科技之星(2015年)、新疆維吾爾自治區(qū)天山英才工程第三層次培養(yǎng)人選和第二層次培養(yǎng)人選(2013年、2017年)。帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)2017年榮獲新疆維吾爾自治區(qū)宮頸癌研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)。

宮頸癌發(fā)生與脂肪酸代謝重編程及代謝調(diào)控的分子機(jī)制研究

惡性增殖是腫瘤的基本特征，消耗大量的原料和能量，故腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)改變代謝譜式來(lái)調(diào)整能量短缺狀態(tài)。這種代謝重編程很大程度上是由腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)和代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的，其通過(guò)直接作用于代謝酶或者通過(guò)一系列胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，間接影響細(xì)胞代謝，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中的流向和流量被重新定義。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討宮頸癌組織代謝組分的變化并分析其關(guān)鍵代謝通路,檢測(cè)代謝關(guān)健酶及能量代謝效應(yīng)分子在宮頸癌中的表達(dá)及對(duì)宮頸癌脂肪酸代謝的影響,為改善宮頸癌患者預(yù)后及腫瘤的靶向治療提供新的參考。

宮頸癌發(fā)生與腫瘤組織代謝物變化及代謝途徑的分析研究

阿仙姑·哈斯木1,努爾滿(mǎn)古力·肉孜1,2，徐麗秀1，哈提拉·吐?tīng)栠d1，馬俊旗3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，烏魯木齊830011；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊830000；3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，烏魯木齊830054)

摘要：目的探討子宮頸癌發(fā)生與腫瘤組織代謝物及代謝途徑關(guān)鍵酶表達(dá)變化的關(guān)系。方法收集子宮頸鱗癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)及慢性宮頸炎(正常對(duì)照)新鮮及石蠟包埋組織標(biāo)本，采用超高效液相色譜聯(lián)合三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)技術(shù)檢測(cè)宮頸組織代謝組分，應(yīng)用正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA )對(duì)UHPLC-MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析，確定3種宮頸組織差異性代謝物組分，并應(yīng)用代謝通路分析軟件(Metabo Analyst和KEGG)綜合分析，預(yù)測(cè)關(guān)鍵代謝通路。采用定量RT-PCR方法和免疫組織化學(xué) SP法檢測(cè)關(guān)鍵代謝通路關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶1(GAD1)、糖原合成激酶3(GSK-3)、丙酮酸激酶(PKM2)和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(CPT1)的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果3種宮頸組織之間有34種差異性小分子代謝物；代謝通路分析預(yù)測(cè)出18條關(guān)鍵代謝通路，其中能量代謝與宮頸癌發(fā)生可能最為密切；定量RT-PCR方法結(jié)果顯示，宮頸癌組織內(nèi)GAD1及GSK-3β表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而PKM2及CPT1表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，從正常對(duì)照組織到CIN和宮頸癌，GAD1和GSK-3β表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，從強(qiáng)陽(yáng)性和中等陽(yáng)性逐漸向弱陽(yáng)性和陰性變化，而PKM2和CPT1蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，進(jìn)一步驗(yàn)證了定量RT-PCR結(jié)果。結(jié)論宮頸癌發(fā)生伴有腫瘤組織內(nèi)糖和脂肪酸分解代謝加劇，能量代謝增強(qiáng)，處于物質(zhì)代謝紊亂的病理狀態(tài)，其可能與關(guān)鍵代謝途徑的限速酶表達(dá)調(diào)控存在密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；能量代謝；組織代謝組分；關(guān)鍵酶

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2018)05-0521-08

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.001

在本研究中，學(xué)生完成二稿的基本程序是，課下按照批改網(wǎng)反饋提示反復(fù)修改作文，然后提交。因教師并沒(méi)有對(duì)修改提出具體要求，所以學(xué)生往往只根據(jù)反饋提示修改個(gè)別錯(cuò)誤，看到分?jǐn)?shù)提高即提交，導(dǎo)致詞匯運(yùn)用能力沒(méi)有得到顯著提高。因此，教師應(yīng)該提出修改次數(shù)的要求，并規(guī)定學(xué)生按批改網(wǎng)的反饋提示逐條修改，如果放棄采納某一提示，需給出原因。這樣做可以使學(xué)生認(rèn)真對(duì)待批改網(wǎng)的反饋，從而將批改網(wǎng)作為促改工具應(yīng)用于寫(xiě)作教學(xué)，這二者的有機(jī)結(jié)合程度會(huì)影響學(xué)生對(duì)批改網(wǎng)的接受程度和利用率（2016）。如果放棄修改的原因是連續(xù)修改失敗，學(xué)生可以求助于同伴或教師。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81360332)

作者簡(jiǎn)介：阿仙姑·哈斯木(1974-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:axiangu75@126.com。

本文引用：阿仙姑·哈斯木,努爾滿(mǎn)古力·肉孜，徐麗秀,等.宮頸癌發(fā)生與腫瘤組織代謝物變化及代謝途徑的分析研究J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018,41(5):521-527,533.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.001

Analysisofthemetabolicchangesandmetabolicpathwaysintumortissuesofcervicalsquamouscellcarcinoma

AxianguHaimu1,NuermanguRouzi1,2,XULixiu1，HatilaTuerxun1，MAJunqi3

(1DepartmentofPathology,SchoolofPre-clinicalMedicine,XingjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofGynaecologyofthePeople′sHospitalofXinjiangAutonomousRegion,Urumqi830000,China;3DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between the progress of squamous cell carcinoma of the cervix and the regulation of metabolic network.MethodsFresh specimens and paraffin-embedded tissue slices form patients with cervical squamous cell carcinoma(CSCC),cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅱ-Ⅲ and normal controls(NC)were collected.Ultra high-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupole mass spectrometry(UHPLC-MS/MS)was performed to identify metabolites in the three group specimens.Orthogonal partial least-squares discriminant analysis(OPLS-DA)was used to model the systematic variation related to patients with CIN or CSCC with healthy controls.The metabolomics data was additionally analyzed by professional softwares recognizing metabolic pathways(KEGG;MetaboAnalyst 2.0)and online databases,to identify certain metabolic pathways and key enzymes associated with the metabolic regulation.Quantitative RT-PCR was used to reveal the association of cervical carcinoma with the mRNA expression level of candidate key enzymes.Meanwhile,the protein expression level of candidate key enzymes in paraffin-embedded tissue specimens were provided by the pathological tissue specimen bank.Results34small molecular metabolites were identified that were different in cervical carcinoma.This profile was comprehensively analyzed by professional softwares for recognizing metabolic pathways(MetaboAnalyst and KEGG)and predicted 18 key metabolic pathways,among which cervical carcinogenesis was the most probably associated with 4key metabolic pathways,the energy metabolism may be the most closely related to the occurrence of cervical cancer.By analysis of transcriptions for candidate genes coding these key enzymes by quantitative RT-PCR,the results showed that the expression of PKM2 and CPT1 was significantly upregulated,and GAD1 and GSK-3β downregulated,respectively,in tissue specimens of cervical carcinoma compared with normal controls(P<0.05).In immunohistochemical staining analysis further confirmed the result of quantitative RT-PCR,the protein expression of GAD1 and GSK-3β was gradually decreased,and PKM2 and CPT1 increased,respectively,from normal controls to precancerous lesions(CIN Ⅱ-Ⅲ)and cervical carcinoma with significant differences(P<0.05).ConclusionThe occurrence of cervical cancer is accompanied by increased glucose and fatty acid catabolism and increased energy metabolism in the tumor tissue.It is in a pathological state of substance metabolism disorder.It may be closely related to the expression of speed limiting enzymes in key metabolic pathways.

Keywords:cervical cancer;energy metabolism;tissue metabolism component;key enzymes

惡性增殖是腫瘤的基本特征，消耗大量的原料和能量，腫瘤細(xì)胞通過(guò)改變特定代謝譜來(lái)調(diào)整能量短缺狀態(tài)[1]。近期，研究者通過(guò)細(xì)胞代謝組分分析發(fā)現(xiàn)了快速鑒別宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物和檢測(cè)方法[2-3]。課題組在前期研究中，對(duì)子宮頸鱗癌和正常對(duì)照的血漿進(jìn)行代謝組分分析，發(fā)現(xiàn)一系列宮頸鱗癌特異的血漿代謝物群，主要是腫瘤患者糖酵解、脂肪酸代謝、氨基酸和核苷酸分解代謝紊亂，間接地反映腫瘤組織能量代謝失調(diào)，腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)及代謝調(diào)控的異常[4-7]。宮頸癌細(xì)胞的誕生與生存不僅伴隨著自身的基因表達(dá)調(diào)控改變，并與代表整體水平變化的代謝水平動(dòng)態(tài)變化也存在一定的因果關(guān)系。臨床上大部分的宮頸癌(cervical carcinoma，CC)都是由宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)演變而來(lái)，因此CIN 是與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)的一組癌前病變，反應(yīng)了宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)連續(xù)性過(guò)程。為了明確宮頸癌演進(jìn)過(guò)程與代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)系，本研究擬利用宮頸鱗癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變及慢性宮頸炎組織進(jìn)行組織代謝組學(xué)研究，并進(jìn)一步分析代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與關(guān)健酶表達(dá)的關(guān)系，從分子水平上進(jìn)一步認(rèn)識(shí)宮頸癌的發(fā)病機(jī)制。

1　資料與方法

1.1臨床標(biāo)本的收集收集2015年1月-2015年9月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科收治的宮頸鱗癌(CSCC)、癌前病變(CINⅡ～Ⅲ)及慢性宮頸炎(正常對(duì)照,NC)活檢組織標(biāo)本共57例，其中宮頸鱗癌患者22例，年齡42～67歲，平均52.7歲，CINⅡ～Ⅲ患者為16例，其中6例為CINⅡ級(jí)，10例為CINⅢ級(jí)，年齡27～51歲，平均47.4歲,慢性宮頸炎29例。宮頸鱗癌患者按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO 2009)的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。手術(shù)后的腫瘤組織樣本用0.9%氯化鈉清洗3次，洗去殘余的血液，迅速于液氮中冷凍，并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。由于倫理原因及組織學(xué)改變特點(diǎn)，臨床上獲得CIN新鮮組織的難度大，故qRT-PCR方法只驗(yàn)證癌及正常組織關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)檢測(cè)所需標(biāo)本為石蠟包埋組織標(biāo)本，其中慢性宮頸炎51例，CINⅡ～Ⅲ38例，宮頸鱗癌34例。

1.2UHPLC-QqQ-MS技術(shù)檢測(cè)組織樣本代謝組分(1)樣本制備及檢測(cè)：取100mg組織樣本，加入200μL H2O后進(jìn)行研磨，然后加入800μL 甲醇：乙腈(1∶1，v/v)，渦旋混勻30s；-20℃靜置1 h；緊接著將樣本4℃，12 000 r/min離心15min；取800μL上清，并用旋轉(zhuǎn)真空濃縮儀室溫下進(jìn)行干燥；加入100μL乙腈：水(1∶1，v/v)進(jìn)行復(fù)溶；4℃水浴超聲10min，助溶；4℃，12 000 r/min離心15min；取上清，-80℃保存直至上機(jī)檢測(cè)。(2)UHPLC色譜條件：柱溫40℃，進(jìn)樣量5μL，樣品室溫度4℃。流動(dòng)相：純水(A)，乙腈(B)，流速為0.4mL/min。(3)TOFMS質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描，電噴霧離子模式，離子源溫度為100℃，除溶劑溫度為300℃；除溶劑氣體流量是3.0L/min。(4)數(shù)據(jù)處理與分析:從原始數(shù)據(jù)中，共獲得9個(gè)質(zhì)量控制樣品(Quality control，QC)和67個(gè)樣品，137個(gè)峰，過(guò)濾后，還有126個(gè)峰。采用 OPLS-DA 模型結(jié)合 student′st檢驗(yàn)(t-test)的P值(閾值0.05)來(lái)尋找差異性表達(dá)代謝物。在每組P<0.05的數(shù)據(jù)中，對(duì)每個(gè)代謝物進(jìn)行倍數(shù)變化，選取同時(shí)倍數(shù)變化明顯的結(jié)果作為差異性代謝物。為了進(jìn)一步分析宮頸癌、癌前病變患者體內(nèi)發(fā)生紊亂的代謝通路，利用發(fā)現(xiàn)的潛在標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路分析。通路分析模塊(pathway analysis module)用于識(shí)別在所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)條件下獲得的與病理狀態(tài)最相關(guān)的代謝通路。通路分析模塊利用KEGG代謝通路作為后臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3qRT-PCR法驗(yàn)證候選限速酶轉(zhuǎn)錄變化提取組織總RNA提取，采用定量RT-PCR法分別對(duì)各候選基因進(jìn)行定量檢測(cè)及分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，根據(jù)每個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和每個(gè)待測(cè)樣品的Ct值為每個(gè)樣品換算出SQ值，即為該候選基因在該樣品中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。以管家基因β-actin為內(nèi)參基因，對(duì)每個(gè)待測(cè)樣品的候選基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到其標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。通過(guò)融解曲線和擴(kuò)增效率分析來(lái)評(píng)估擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。最終按照候選基因[谷氨酸脫羧酶1(GAD1)、糖原合成激酶3(GSK-3)、丙酮酸激酶(PKM2)和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(CPT1)]和內(nèi)參基因平均SQ值的比較評(píng)估或推算候選基因的相對(duì)表達(dá)量。編碼候選基因mRNA序列特異性引物信息見(jiàn)表1。

1.4免疫組織化學(xué)方法對(duì)選擇的石蠟包埋的組織標(biāo)本，進(jìn)行3 μm 厚的切片，按照北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司免疫組織化學(xué)SP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法檢測(cè)宮頸組織中GAD1、GSK-3、PKM2和CPT1蛋白質(zhì)的表達(dá)。顯微鏡下評(píng)分(陽(yáng)性范圍+強(qiáng)度，0～6分)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性范圍：0分：陰性，1分：0<范圍≤30%，2分：30%<范圍≤60%，3分：>60%；陽(yáng)性強(qiáng)度：0分：陰性；1分：弱陽(yáng)性；2分：陽(yáng)性；3分：強(qiáng)陽(yáng)性。綜合積分=(陽(yáng)性范圍+陽(yáng)性強(qiáng)度)/2。綜合判定:積分<1：陰性(-)；1 分：+；2分：++；3分：+++。

表1　編碼候選基因的mRNA序列特異性引物信息

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P值采用雙邊檢測(cè)，3組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析，2組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn)；等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)，多組間比較用Kruskall-Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1宮頸癌、CIN和慢性宮頸炎組織代謝組分分析UHPLC-QqQ-MS技術(shù)檢測(cè)宮頸組織代謝組分，發(fā)現(xiàn)原始數(shù)據(jù)中有137個(gè)峰，對(duì)其進(jìn)行主成分PCA分析和OPLS-DA分析，分別獲得Total PCA得分圖(圖1)和OPLS-DA得分圖(圖2)。PCA得分圖不能有效地區(qū)分宮頸癌、CIN及慢性宮頸炎組織的代謝組分，故進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA 分析，發(fā)現(xiàn)R2Y、Q2越接近1，說(shuō)明OPLS-DA 模型越能很好地解釋2組樣本之間的差異(圖2a～圖2c)。通過(guò)排列實(shí)驗(yàn)隨機(jī)多次(n=200)改變分類(lèi)變量y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2值對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)，結(jié)果如圖2d～2f所示，置換檢驗(yàn)截距(R2=0.722，Q2=-0.229)可以很好體現(xiàn)模型的穩(wěn)健性。鑒于結(jié)合模型的高度有效性，我們接下來(lái)的標(biāo)志物篩查均建立在結(jié)合模型基礎(chǔ)上。不同組模型參數(shù)的排列分析如下：正常對(duì)照與宮頸癌：(R2=0.72，Q2=-0.23)；正常對(duì)照與 CIN：(R2=0.67，Q2=-0.29)；CIN與宮頸癌：(R2=0.72，Q2=-0.23)。

宮頸癌與NC，CIN與NC，宮頸癌與CIN之間的差異性代謝物的比較見(jiàn)表1(表中紅色和藍(lán)色字體為取閾值VIP>1 且P-VALUE<0.05的差異物，紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào))。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩查步驟，共發(fā)現(xiàn)34個(gè)有意義的代謝物。與NC相比，宮頸癌有14個(gè)差異性代謝物；與NC相比，CIN有15個(gè)差異性代謝物；與CIN相比，宮頸癌有9個(gè)差異性代謝物，見(jiàn)表2。

圖2　不同宮頸組織OPLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)圖

表2　CSCC、CIN 與正常對(duì)照之間的差異性代謝物的比較

2.2宮頸癌、CIN和正常對(duì)照組織差異代謝物的通路分析根據(jù)代謝通路KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，與正常對(duì)照相比共發(fā)現(xiàn)了18條與宮頸癌相關(guān)的發(fā)生紊亂的代射通路(圖3)。這些代謝途徑組成能量和氨基酸代謝，包括脂肪酸合成及分解、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成和蛋白質(zhì)的消化及吸收等。

2.3宮頸癌發(fā)生與腫瘤組織內(nèi)候選限速酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)關(guān)系對(duì)61例宮頸癌和正常對(duì)照組織RNA進(jìn)行定量RT-PCR篩查分析，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織內(nèi)GAD1及GSK-3β等調(diào)節(jié)氨基酸代謝和糖原合成代謝途徑的限速酶表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而PKM2及CPT1等調(diào)節(jié)糖酵解和脂肪酸分解代謝的限速酶表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。提示宮頸癌發(fā)生與腫瘤組織內(nèi)限速酶表達(dá)異?？赡芟嚓P(guān),見(jiàn)表3。

表3　4種候選基因表達(dá)水平的定量RT-PCR分析

2.4宮頸癌發(fā)生與腫瘤組織內(nèi)候選限速酶蛋白表達(dá)關(guān)系GSK-3β、PKM2和CPT1的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，GAD1的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核(圖4)。從慢性宮頸炎到CIN和宮頸癌，GAD1和GSK-3β表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，從強(qiáng)陽(yáng)性和中等陽(yáng)性逐漸向弱陽(yáng)性和陰性變化，而PKM2和CPT1蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)驗(yàn)證了上述定量RT-PCR分析結(jié)論(表4～7)。

圖3　差異性代謝物的代謝通路圖

圖4　PKM2、CPT1、 GSK-3β和GAD1在宮頸癌及慢性宮頸炎組織中的表達(dá)(×200)

表4　不同宮頸病變組織中GAD1蛋白水平差異

注:多組間秩和檢驗(yàn),aP<0.05；與慢性宮頸炎比較，bP<0.05;與CIN比較,cP<0.05。

表5　不同宮頸病變組織中GSK-3β蛋白水平差異

注:多組間秩和檢驗(yàn),aP<0.05；與慢性宮頸炎比較，bP<0.05;與CIN比較,cP<0.05。

表6　不同宮頸病變組織中PKM2蛋白水平差異

注:多組間秩和檢驗(yàn),aP<0.05；與慢性宮頸炎比較，bP<0.05;與CIN比較,cP<0.05。

表7　不同宮頸病變組織中CPT1蛋白水平差異

注:多組間秩和檢驗(yàn),aP<0.05；與慢性宮頸炎比較，bP<0.05;與CIN比較,cP<0.05。

3　討論

研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞的存活和快速增殖與腫瘤細(xì)胞的代謝密切相關(guān)[8-10]。而腫瘤細(xì)胞代謝改變很大程度上是由腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)和代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的，其通過(guò)直接作用于代謝通路關(guān)健酶或者通過(guò)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，間接影響腫瘤細(xì)胞代謝，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中的流動(dòng)方向和流動(dòng)量被重新定義[11-12]。因此，異常的腫瘤細(xì)胞代謝的改變可作為惡性腫瘤的一個(gè)重要特點(diǎn)。

本研究前期研究通過(guò)NMR技術(shù)手段和OPLS-DA分析方法對(duì)宮頸癌和CIN患者血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CIN患者血漿中極低密度脂蛋白、不飽和脂肪酸和丙酮含量增加，而乳酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、肌酸、異亮氨酸和1-甲基組氨酸等多種氨基酸含量減少。宮頸癌患者血漿中有較高水平的甲酸和乙酸，但支鏈氨基酸等水平降低，提示宮頸癌患者多種能量代謝的紊亂[4-5]。利用高效液相色譜(HPLC)代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變及健康人血漿游離氨基酸含量改變，發(fā)現(xiàn)CIN和宮頸癌患者在不同發(fā)展階段血漿存在明顯的氨基酸代謝異常，由此得出，宮頸癌細(xì)胞可能選擇性地從血漿中攝取特定氨基酸來(lái)滿(mǎn)足自身不同階段的生長(zhǎng)需求[6-7]。以上研究提示，腫瘤的發(fā)生伴隨著組織或細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生明顯改變，這種變化可能已經(jīng)體現(xiàn)在機(jī)體體液代謝物中，其表現(xiàn)為一種體液代謝水平或代謝物的含量的“微調(diào)”，是腫瘤早期預(yù)警的重要標(biāo)記。此種“微調(diào)”暗示或預(yù)示著腫瘤發(fā)生或生存，并提供腫瘤組織中各種代謝通絡(luò)發(fā)生相關(guān)的重要信息。

為了明確宮頸癌演進(jìn)過(guò)程與代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)系，我們利用宮頸癌、CIN和正常對(duì)照組織進(jìn)行組織代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)糖酵解代謝，脂肪酸-β氧化和谷氨酰胺氧化代謝增強(qiáng)，并篩選出與宮頸癌進(jìn)展相關(guān)的34種小分子代謝物。進(jìn)一步分析代謝通路關(guān)健酶活性，發(fā)現(xiàn)宮頸腫瘤組織內(nèi)GAD1轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降，從氨基酸代謝調(diào)控角度分析，推測(cè)腫瘤組織細(xì)胞可能處于一種逆轉(zhuǎn)氨基酸分解代謝的應(yīng)激狀態(tài)，不僅是保護(hù)細(xì)胞內(nèi)氨基酸資源的早期事件，也是腫瘤細(xì)胞補(bǔ)充氨基酸的補(bǔ)償性反應(yīng)，此為揭示腫瘤細(xì)胞內(nèi)氨基酸合成代謝和分解代謝之間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制提供重要依據(jù)。GSK-3β是一個(gè)多功能激酶，參與蛋白合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及腫瘤發(fā)生等多方面，扮演著重要角色 。目前，GSK3β在腫瘤發(fā)生和發(fā)展方面存在爭(zhēng)議，研究者認(rèn)為p-GSK3βtyr216是一種GSK3β激活狀態(tài)，在腫瘤組織內(nèi)以高表達(dá)，促進(jìn)Cyclin D等細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和增殖，而抑制p-GSK3βtyr216活性，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡[13]。p-GSK3βser9是GSK3β失活狀態(tài)，而腫瘤組織內(nèi)高表的GSK3β可能以p-GSK3βser9形式存在[14]。本研究中，GSK-3β在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，提示GSK-3β在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到一定的抑制作用，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

PKM2作為糖酵解途徑中重要的限速酶，參與的反應(yīng)是催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。在研究中，PKM2編碼基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在腫瘤組織內(nèi)顯著升高，提示PKM2高表達(dá)使腫瘤細(xì)胞在高速增殖、缺氧和能量匱乏的微環(huán)境中，獲得以糖酵解方式攝取能量的能力，在腫瘤代謝形式的變更及能量供給過(guò)程中起著重要作用。本研究中，脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵酶CPT-1在宮頸癌組織表達(dá)上調(diào)。脂質(zhì)合成與分解代謝的異常是腫瘤細(xì)胞代謝重編程的重要特征。在腫瘤細(xì)胞中，一方面脂肪酸的從頭合成明顯增加，以滿(mǎn)足細(xì)胞增殖對(duì)脂質(zhì)的需要；另一方面當(dāng)腫瘤細(xì)胞缺乏葡萄糖時(shí)，將通過(guò)增強(qiáng)脂肪酸β-氧化來(lái)滿(mǎn)足細(xì)胞對(duì)能量的需求[15]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

本研究宮頸癌組織中糖酵解代謝，脂肪酸-β氧化和谷氨酰胺氧化代謝增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其代謝關(guān)鍵酶表達(dá)異常，說(shuō)明宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞代謝異常相關(guān)，而代謝酶異常表達(dá)可能是引起腫瘤細(xì)胞代謝異常的關(guān)鍵。可見(jiàn)，研究腫瘤細(xì)胞異常代謝與腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系，以及研究代謝關(guān)鍵酶異常表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝的調(diào)控機(jī)制對(duì)揭示腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制非常必要。本課題組將進(jìn)一步從細(xì)胞和動(dòng)物模型水平上，明確代謝關(guān)鍵酶、能量代謝效應(yīng)分子調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制以及影響整體代謝組的規(guī)律。

[收稿日期：2018-02-27]

(本文編輯楊晨晨)