王　菁，古娜娜·對山別克，海力茜·陶爾大洪

(1新疆維吾爾自治區(qū)第六人民醫(yī)院藥劑科;新疆醫(yī)科大學(xué)2附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部;3藥學(xué)院，烏魯木齊　830011)

·藥學(xué)研究·

新疆蕪菁總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝研究

王菁1，古娜娜·對山別克2，海力茜·陶爾大洪3

(1新疆維吾爾自治區(qū)第六人民醫(yī)院藥劑科;新疆醫(yī)科大學(xué)2附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部;3藥學(xué)院，烏魯木齊830011)

摘要：目的研究大孔吸藥劑科附樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的工藝條件。方法以比吸附量、吸附率、解吸率為指標，采用靜態(tài)吸附對5種大孔吸附樹脂進行篩選；采用UV法以上樣液濃度、吸附流速、樹脂柱徑高比、泄露曲線、洗脫劑濃度、吸附次數(shù)、洗脫曲線等參數(shù)為指標對純化工藝進行篩選。結(jié)果用HPD-100大孔樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的最佳工藝為：層析柱徑高比1∶10，上樣速率2mL/min，上樣質(zhì)量濃度0.24mg/mL，重復(fù)吸附1次，洗脫劑95%乙醇，洗脫劑用量1BV。結(jié)論HPD-100樹脂適合于新疆蕪菁總黃酮的分離與純化。

關(guān)鍵詞：新疆蕪菁；總黃酮；大孔吸附樹脂；純化

中圖分類號：R943

文獻標識碼：A

西雙說的確是這樣。什么叫夫妻？患難與共才叫夫妻，對不對？現(xiàn)在我借給她們?nèi)f塊錢，這三萬塊錢，她們必須得還。假如我們復(fù)了婚，這三萬塊錢，就變成共同財產(chǎn)，擁有者變成我和她，當然就不必還了。你聽說過哪位妻子還他丈夫的錢嗎？更何況還是給她治病的錢。

文章編號：1009-5551(2018)05-0606-04

排除標準：①有頸椎病手術(shù)史；②由脊髓腫瘤、外傷或其他疾病引起的頸椎?。虎酃潭ü?jié)段不在此范圍或聯(lián)合其他手術(shù)的患者。

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.019

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81460615)

作者簡介：王菁(1986-)，女，碩士，藥師，研究方向：天然藥物分析。

通信作者：海力茜·陶爾大洪，女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然藥物的開發(fā)和研究，E-maiL:haiLiqian2471@sina.com。

本文引用：王菁，古娜娜·對山別克，海力茜·陶爾大洪.新疆蕪菁總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018,41(5):606-609.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.019

PurificationoftotalflavonoidsoftheXinjiangBrassicarapaL.bymacroporousresin

WANGJing1，GunanaDuishanbieke2，HailiqianTaoerdahong3

(1DepartmentofPharmacy,theSixthPeople′sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,2DepartmentofPharmacy,theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,3SchoolofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo study the purification technology of total flavonaoids of XinjiangBrassicarapaL.Methods5 different macroporous resins were compared by static absorption method with adsorption capacity,adsorption rate,desorption rate as indexes.Using the concentration of sample solution,flow velocity,ratio of diameter to height,adsorption-leakage curve,concentration of eluent,times of adsorption,elution curve as indexes,the purification technology was optimized by UV.ResultsThe optimal purification technology of HPD-100 macroporous resin was as follows:the rate of diameter to height is 1:10,sampling flow rate as 2mL/min,the concentration of the sample solution flow rate was 0.24mg/mL,repeated adsorbing again,eluting with 95% ethanol,elute volume was 1BV.ConclusionThe HPD-100 macroporous resin can be applied to separate and purify of total flavonoids of the XinjiangBrassicarapaL.

Keywords:XinjiangBrassicarapaL.;total flavonoids;macroporous resin;purification

新疆蕪菁(XinjiangBrassicarapaL.)為十字花科植物蕓苔屬蕓苔種蕪菁亞種2年生草本植物的塊根[1]，其花為蕪菁花，種子為蕪菁子。新疆蕪菁根莖扁圓，味道與國內(nèi)其他產(chǎn)地有所不同，是一個地方品種,主要含有黃酮、多糖、硫代葡萄糖苷等化學(xué)成分[2-3]?！毒S吾爾藥志》記新疆蕪菁性溫，具有開胸順氣、健胃消食、利濕解毒、平喘止咳等功效，用于胸悶腹胃脹痛、食欲不振、瘡癤腫毒等疾病的治療[4]。近代藥理研究表明，新疆蕪菁還具有抗誘變[5]、抗衰老[6]、抗輻射、延長果蠅的壽命[7]、抑制肝癌細胞生長[8]等作用。本研究采用紫外分光光度法，通過單因素實驗和正交實驗對新疆蕪菁總黃酮的最佳提取工藝進行了篩選，對新疆蕪菁總黃酮進行了純化研究，現(xiàn)報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器UV-1102型紫外-可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，KQ-300VDE型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)W-200型萬能粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，AB135-S型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2試藥蘆丁標準品(中國藥品生物制品鑒定所，批號0080-9705)，D101型、HPD-100型、HPD-300型、HPD-400型樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，AB-8型樹脂(天津市光復(fù)精細化工研究所)，氫氧化鈉(天津市富宇精細化工有限公司，批號20170312)，亞硝酸鈉(天津市富宇精細化工有限公司，批號20161210)，氫氧化鋁(天津市富宇精細化工有限公司，批號20170212)，95%乙醇(天津市富宇精細化工有限公司，批號20170428)，均為分析純，水為蒸餾水。

1.3藥材蕪菁藥材2016年9月購自新疆艾力努爾農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室帕麗達教授鑒定為十字花科植物蕓苔屬蕓苔種蕪菁亞種二年生草本植物新疆蕪菁(Xinjiang Brassica rapa L.)的塊根。

2　方法與結(jié)果

2.1樹脂預(yù)處理將5種型號(HPD-100、HPD-300、HPD-400、D101和AB-8)的大孔樹脂，用95%的乙醇溶液浸泡24h，使其充分的溶脹，濕法裝柱，用蒸餾水-乙醇(1∶5)沖洗至流出液不呈白色渾濁為止，再用蒸餾水洗至無醇味，自然晾干，備用。

2.2新疆蕪菁總黃酮的制備稱取新疆蕪菁5 g，加75%乙醇溶液300mL回流提取2.5 h，濾過，減壓濃縮，然后用蒸餾水定容至25mL，備用。

2.3標準曲線的繪制吸取對照品溶液1、2、3、4、5、6mL分別置于25mL容量瓶中，各依次加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，振搖后放置5min，加入 10%硝酸鋁溶液1mL，振搖后放置6min，加4%氫氧化鈉溶液10mL，用60%乙醇定容至刻度，以60%乙醇作為空白對照，測定510 nm處的吸光度，以蘆丁溶液濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，得到標準溶液濃度與吸光度之間的回歸方程Y=13.364X-0.008 6(r=0.9993)，表明線性關(guān)系良好。

2.4靜態(tài)吸附-解吸性能考察試驗將預(yù)處理的5種型號大孔樹脂D101、AB-8、HPD-100、HPD-300和HPD-400各稱取1g分別置于50mL具塞三角瓶中，加入樣品溶液25mL(總黃酮濃度為2.0341mg/g)，放入振蕩器振搖6h，靜置24h后，過濾。用蒸餾水定容至25mL容量瓶，再從中吸取5mL用蒸餾水至25mL容量瓶，按“2.3”項下方法測定吸光度，按公式：比吸附量=(初始質(zhì)量濃度-剩余質(zhì)量濃度)×溶液體積/干樹脂質(zhì)量，計算總黃酮比吸附量。將充分吸附的5種型號大孔樹脂分別置于50mL具塞三角瓶中，加入75%乙醇25mL進行解析，在振蕩器振搖6h，靜置24h后，過濾，用蒸餾水定容至25mL容量瓶，再從中吸取10mL定容至25mL容量瓶，按“2.3”項下方法測定吸光度，按公式：比解吸量=(解吸液質(zhì)量濃度×解洗液體積)/干樹脂質(zhì)量，解吸率=比解吸量/比吸附量×100%，計算總黃酮比解吸量和解吸率。結(jié)果5種樹脂中HPD-100的吸附量最高并且解吸率也為最高，故采用HPD-100型樹脂純化富集新疆蕪菁總黃酮，見表1。

表1　不同大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果

2.5動態(tài)吸附實驗

2.5.1徑高比對HPD-100型樹脂吸附量的影響稱取預(yù)處理好的HPD-100的大孔樹脂10、20、30g，分別濕法上柱裝于同一型號(2.1cm×11cm)的柱子中，徑高比分別為1∶5、1∶10、1∶15，分別加入“2.2”項下制備的新疆蕪菁總黃酮提取液(1.79mg/g)25mL，吸附2次，靜置1 h，用2BV(柱體積)蒸餾水以2mL/min的流速通過層析柱洗脫雜質(zhì)，收集流出液定容至250mL容量瓶，吸取流出液5mL，按“2.3”項下方法測定流出液中總黃酮含量，計算樹脂比吸附量。再用75%乙醇沖洗柱子，至洗脫液無色透明，將洗脫液置于250mL容量瓶，定容后精密吸取10mL，按“2.3”項下方法測定其中黃酮的含量，計算解吸率，結(jié)果當徑高比1∶10時，總黃酮的比吸附量、比解吸量和解吸率最好，見表2。

表2　徑高比對HPD-100型樹脂吸附量的影響(n=3)

2.5.2上樣液濃度對HPD-100樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的影響取3份預(yù)處理好的HPD-100的大孔樹脂，徑高比1∶10，分別濕法上柱裝于同一型號(2.1cm×11cm)的柱子中，取上樣原液3份各25mL(總黃酮濃度為2.4mg/g)，分別加入蒸餾水0、25、50mL，吸附2次，靜置1 h，用2 BV蒸餾水以2mL/min的流速通過層析柱洗脫雜質(zhì)，收集流出液，定容至250mL容量瓶，吸取5mL，按“2.3”項下測定流出液中總黃酮量，計算樹脂比吸附量。再用75%乙醇沖洗柱子，至洗脫液無色透明，將洗脫液置于250mL容量瓶，定容后精密吸取10mL，按“2.3”項下方法測定黃酮的含量，計算解吸率。當上樣溶液中黃酮濃度為0.48mg/mL時，比吸附量較大，但濃度太高，使其在解吸時不能完全解吸下來；當黃酮濃度為0.12mg/mL時，比吸附量，比解吸量和解吸率與黃酮濃度為0.24mg/mL相差不大，故選擇黃酮濃度為0.24mg/mL，見表3。

表3　上樣液總黃酮濃度對HPD-100樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的影響(n=3)

2.5.3吸附次數(shù)對HPD-100樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的影響取3份預(yù)處理好的HPD-100的大孔樹脂，徑高比1∶10，分別濕法上柱裝于同一型號(2.1cm×11cm)的柱子中，取上樣原液3份各25mL(總黃酮濃度為2.38mg/g)，靜置1 h，以不同吸附次數(shù)，吸附完全后，用2 BV蒸餾水以2mL/min的流速通過層析柱洗脫雜質(zhì)，收集流出液，定容至250mL容量瓶，吸取5mL，按“2.3”項下方法測定流出液中總黃酮量，計算樹脂比吸附量。再用75%乙醇沖洗柱子，至洗脫液無色透明，將洗脫液置于250mL容量瓶，定容后精密吸取10mL，按“2.3”項下方法測定其中黃酮的含量，計算解吸率。吸附2次時新疆蕪菁總黃酮的比吸附量、比解吸量和解吸率較高，見表4。

2.5.4上樣速率對HPD-100樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的影響取預(yù)處理好的3份HPD-100的大孔樹脂，徑高比1∶10，分別濕法上柱裝于同一型號(2.1cm×11cm)的柱子中，取上樣原液3份各25mL(總黃酮濃度為2.38mg/g)，靜置1 h，吸附2次，靜置1 h，用2 BV蒸餾水分別以1、2、3mL/min的流速通過3個層析柱洗脫雜質(zhì)，收集流出液，定容至250mL容量瓶，吸取5mL，按“2.3”項下方法測定流出液中總黃酮量，計算樹脂比吸附量。再用75%乙醇沖洗柱子，至洗脫液無色透明，將洗脫液置于250mL容量瓶，精密吸取10mL，按“2.3”項下方法測定黃酮的含量，計算解吸率。當上樣速率為2mL/min時，新疆蕪菁的總黃酮解吸率較高，見表5。

表4　吸附次數(shù)對HPD-100樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的影響(n=3)

表5　上樣速率對HPD-100樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的影響(n=3)

2.5.5不同洗脫劑濃度對HPD-100樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的影響取預(yù)處理好的3份HPD-100的大孔樹脂，徑高比1∶10，分別濕法上柱裝于同一型號(2.1cm×11cm)的柱子中，取上樣原液4份25mL(總黃酮濃度為2.20mg/g)，靜置1 h，吸附2次，靜置1 h，用2 BV蒸餾水以2mL/min的流速通過層析柱洗脫雜質(zhì)，收集流出液，定容至250mL容量瓶，精密吸取5mL，按“2.3”項下方法測定流出液中總黃酮量，計算樹脂比吸附量。再分別用35%、55%、75%和95%乙醇進行沖洗柱子，收集流出液，定容至250mL容量瓶，吸取10mL，按“2.3”項下方法測定其中黃酮的含量。當乙醇濃度的不斷升高，產(chǎn)物的比吸附量，比解吸量及解吸率也隨之升高，故選用95%乙醇作為洗脫溶劑，見表6。

表6　不同洗脫劑濃度對HPD-100樹脂純化新疆蕪菁總黃酮的影響(n=3)

2.5.6泄露曲線的繪制將質(zhì)量濃度為2.20mg/g的樣品液加入已處理好的HPD-100樹脂柱(徑高比1∶10)，以2mL/min的流速進行動態(tài)吸附，靜置1 h，流出液每10mL收集一管，在510 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量，以管數(shù)為橫坐標(X)，總黃酮吸光度值為縱坐標(Y)，繪制樹脂的泄露曲線。當上樣體積達到60mL時，即上樣總體積的30%時，黃酮已經(jīng)出現(xiàn)明顯的泄露，說明樹脂柱不能完全的吸附藥液中的總黃酮，為了使總黃酮保留完全，將最大的上樣量30%定為上樣量，見圖1。

2.5.7洗脫液用量的選擇吸取25mL “2.2”項下制備的新疆蕪菁總黃酮提取液(2.19mg/g)加入已處理好的HPD-100樹脂柱(徑高比1∶10)，靜置1 h，吸附2次，吸附完全后，用2 BV蒸餾水以2mL/min的流速通過層析柱洗脫雜質(zhì)，再用95%的乙醇洗脫，每10mL為1個流分，測定各流份中總黃酮含量，直至洗脫液基本無色時停止，結(jié)果在洗脫至90mL(1 BV)洗脫劑時，總黃酮可基本完全洗脫，故選擇95%乙醇1 BV。

2.6純化工藝驗證稱取樣品50 g，加75%乙醇溶液3000mL回流提取2.5 h，減壓濃縮并定容至500mL容量瓶。量取樣品溶液120mL(初始黃酮濃度2.20mg/g)，按上述確定的工藝上柱，樹脂100 g(徑高比1∶10)，靜置1 h，吸附2次，2 BV蒸餾水(900mL)以2mL/min的流速進行洗脫，棄去蒸餾水，再用1 BV(450mL)95%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，按“2.3”項下方法操作測定總黃酮含量。純化后總黃酮含量提高了約10倍，說明HPD-100樹脂對新疆蕪菁總黃酮具有良好的純化作用，見表7。

表7　純化工藝驗證實驗結(jié)果(n=3)

3　討論

新疆蕪菁在新疆的南部種植廣泛，當?shù)鼐S吾爾族等少數(shù)民族稱之為恰瑪古兒[9-12]。大孔吸附樹脂技術(shù)具有成本較低、選擇性好、再生處理簡單、吸附速度快等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)于天然藥物中有效成分的分離純化[13-14]。本研究通過靜態(tài)吸附-解吸性能考察對多種型號的大孔吸附樹脂進行比較，最終選用HPD-100型大孔吸附樹脂，并對其純化新疆蕪菁總黃酮的工藝條件進行考察研究。最佳提取工藝為：層析柱徑高比1∶10，上樣速率2mL/min，上樣質(zhì)量濃度0.24mg/mL，重復(fù)吸附1次，洗脫劑95%乙醇，洗脫劑用量1 BV。純化工藝驗證結(jié)果示，本工藝純化后總黃酮含量較樣品液中總黃酮初始含量提高了約10倍。該方法操作簡單、工藝穩(wěn)定，為新疆蕪菁總黃酮成分的進一步精制及其藥用價值的開發(fā)提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

[收稿日期：2017-07-06]

(本文編輯施洋)