孟 哲，李海禹，陶海龍

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內科， 河南 鄭州 450052)

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是包括高血壓、心梗和瓣膜病在內的多種心臟疾病發(fā)展到一定程度時所共有的病理改變，是心室重構的主要表現(xiàn)之一[1]。因此，預防和逆轉MF和心室重構已成為心血管系統(tǒng)相關疾病研究者們的重點課題。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是與細胞外基質(extracellular matrixc，ECM)積聚關系非常密切的細胞因子，是促進細胞纖維化的生長元素。Smad3蛋白是TGF-β1信號在胞質內傳導的重要分子，與ECM合成及致纖因子分泌等多種生物學行為密切相關[2]。蝦青素(astaxanthin，ASTX)隸屬胡蘿卜素家族葉黃素亞屬，存在于大多數(shù)甲殼類動物和鮭科魚類體內[3]。已有研究顯示，ASTX能夠通過抑制氧化應激和炎癥反應，對2型糖尿病和心血管疾病起到抑制作用[4]。此外，Yang等[5]發(fā)現(xiàn)，ASTX能夠下調高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠血脂水平，增強肝臟內抗氧化酶活性。

本研究探討ASTX對TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)內活性氧(reactive oxygen spices，ROS)生成和膠原蛋白分泌的影響，以及這種作用與TGF-β1/Smad3信號通路間的關系，旨在探討ASTX改善心肌纖維化的內在分子機制，為其在臨床上用于慢性心力衰竭的治療提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；ASTX、胎牛血清、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、TGF-β1(美國Sigma公司)；實時定量PCR試劑盒及逆轉錄試劑盒(北京TransGen公司)；兔抗大鼠I型膠原(college Ⅰ，Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原(college Ⅲ，Col Ⅲ)、Smad3、p-Smad3、β-actin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；Smad3-siRNA由南京金絲瑞生物有限公司合成。

1.1.2儀器 iMarkTM酶標儀(美國Bio-Rad公司)；超凈臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術發(fā)展有限公司)；MCO175型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CS-15R冷凍離心機(美國Beckman公司)；IQ5熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2CFs的分離與培養(yǎng)無菌條件下，分離2～3 d SD乳鼠左心室，剪碎至1 mm3～2 mm3組織塊，消化法進行培養(yǎng)[9]。細胞呈單細胞混懸液時，差速貼壁90 min，去上清，加入15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基及雙抗(0.1 U·L-1的青霉素和0.1 mg·L-1的鏈霉素)，放入37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合至 80%～90%時，用于后續(xù)實驗。

1.3MTT法測定不同濃度ASTX對細胞活性的影響將細胞按 5×104個每孔的密度接種于96孔板，按照“1.2”項下條件培養(yǎng)24 h后，改用2%低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，將CFs分為空白對照組、ASTX組(5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)，分別給予相應濃度的ASTX干預24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，37℃孵育4 h后，棄去上清，每孔加入100 μL DMSO，震蕩混勻后，于570 nm處測定吸光度(OD)值。

1.4DCFH-DA法測定CFs細胞內ROS合成將DCFH溶于10 mmol·L-1甲醇溶液，Hank’s平衡液稀釋至20 μmol·L-1待用。CFs分為空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+ASTX(5、10、20 μmol·L-1)組及ASTX組。TGF-β1+ASTX組用ASTX(5、10、20 μmol·L-1)預處理CFs細胞24 h后，加入DCFH孵育1 h，再給予2 mg·L-1TGF-β1刺激30 min；TGF-β1組僅給予2 mg·L-1TGF-β1刺激30 min；ASTX組僅給予ASTX 20 μmol·L-1預處理，酶標儀測定各組熒光強度，結果以每微克細胞蛋白中的熒光強度表示。

1.5qPCR測定ColⅠ和ColⅢmRNA表達按“1.2”項所述方法培養(yǎng)細胞，“1.4”項所述方法對各組細胞進行分組及處理后，Transzol試劑盒提取各組細胞總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，260 nm處檢測RNA的純度。按照逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒操作步驟進行反轉錄及實時熒光定量PCR反應。q-PCR引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見Tab 1。PCR擴增條件：95℃預變性5 min，95℃ 15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共計42個循環(huán)。使用Bio-Rad IQ7熒光PCR儀自帶分析軟件對qPCR結果進行分析。

Tab 1 Prime sequence and PCR product length

1.6Westernblot檢測ColⅠ、ColⅢ、Smad3磷酸化水平按“1.2”項所述方法培養(yǎng)細胞，“1.4”項所述方法對各組細胞進行分組及處理后，每孔使用150 μL RIPA裂解液提取蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣品蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸后，制作12% SDS-PAGE凝膠進行電泳，半干轉膜儀轉膜。一抗?jié)舛葹椋篊ol Ⅰ(1 ∶250)、Col Ⅲ(1 ∶400)、Smad(1 ∶200)、p-Smad3(1 ∶200)、β-actin(1 ∶2 000)。以β-actin作為內參。化學發(fā)光法檢測，Quantity one軟件進行圖像分析。

1.7CFs轉染Smad3-siRNA后ColⅠ、ColⅢmRNA表達檢測Smad3-siRNA干擾序列：R:5′-CGCAGAACGUGAACACCAAdTdT-3′，F(xiàn):3′-dTdTGCGUCUUGCACUUGUGGUU-5′，對Smad3基因進行沉默，按“1.2”項下方法進行培養(yǎng)，待細胞融合率達到80%～90%時轉染，Lipofectamine 2 000作為載體，轉染過程嚴格根據(jù)試劑盒進行。CFs分為空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+ASTX(20 μmol·L-1)組、TGF-β1-Smad3-siRNA及TGFβ1-Smad3-siRNA-ASTX組，檢測各組CFs細胞的Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA表達水平。

2 結果

2.1ASTX對CFs活性的影響如Fig 1所示，ASTX在0～20 μmol·L-1范圍內，無明顯的細胞毒性。因此，后續(xù)實驗中選擇0、5、10、20 μmol·L-1ASTX用于后續(xù)實驗。

Fig 1 Effect of different concentrations ofASTX on cell activity (n=8 )*P<0.05 vs control group

2.2ASTX對TGF-β1誘導的CFs內ROS合成的影響如Fig 2所示，與空白對照組相比，TGF-β1組ROS合成明顯增加(P<0.01)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+ASTX(5、10、20 μmol·L-1)組ROS合成明顯降低(P<0.01)，且降低程度呈劑量依賴性；ASTX組ROS合成無明顯變化(P>0.05)。

Fig 2 Effects of different concentrations of ASTX on ROSproduction of CFs induced by TGF-β1 in CFs n=8)

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTGF-β1 group

2.3ASTX對TGF-β1誘導的CFs中ColⅠ、ColⅢ表達的影響如Fig 3A所示，與空白對照組相比較，TGF-β1組Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達明顯升高。與TGF-β1組相比較，TGF-β1+ASTX(5、10、20 μmol·L-1)組Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達明顯下降(P<0.01)，并呈劑量依賴性。ASTX組Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達無明顯改變(P>0.05)。此外，ASTX亦能夠明顯抑制TGF-β1誘導的Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA表達(P<0.01),見Fig 3B。

2.4ASTX對CFs中Smad3磷酸化和核轉位的影響如Fig 4A所示，與空白對照組相比，TGF-β1組Smad3的磷酸化水平明顯升高(P<0.01)；與TGF-β1組比較，TGFβ1+ASTX(5、10、20 μmol·L-1)組Smad3的磷酸化水平明顯降低(P<0.01)。此外，與空白對照組相比，TGF-β1組核內的Smad3表達明顯升高(P<0.01)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+ASTX(5、10、20 μmol·L-1)組核內的Smad3表達明顯降低(P<0.01)，見Fig 4 B。

2.5Smad3激活介導TGF-β1誘導的CFsColⅠ、ColⅢmRNA表達如Fig 5所示，Smad3-siRNA能夠明顯抑制TGF-β1誘導的CFs細胞Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA表達(P<0.01)。較單用Smad3-siRNA組相比，Smad3-siRNA聯(lián)用ASTX(20 μmol·L-1)則能夠進一步減少TGF-β1誘導的CFs細胞Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA表達(P<0.01)。

Fig 3 Effects of different concentrations of ASTXon Col Ⅰ and Col Ⅲ protein(A) and mRNA (B) expression in CFs induced by TGFβ1 n=8)

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTGF-β1 group

3 討論

慢性心力衰竭是常見心臟疾患終末期的共同臨床表現(xiàn)，心肌纖維化程度的不斷加重是構成慢性心力衰竭的重要病理表現(xiàn)[6]。CFs已被證實能夠通過過度增殖、合成膠原蛋白、上調氧化應激反應、分泌纖維化因子、炎癥因子和黏附分子等途徑，促進心肌纖維化的發(fā)展[7]。因此，調節(jié)病理狀態(tài)下的CFs異常生物學行為，極有可能成為抑制心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。

TGF-β1是一種強有力的促纖維化因子，能夠明顯誘導CFs病理性增殖、表型變化和膠原蛋白合成與分泌[8]。此外，氧化應激導致ROS在CFs內聚集，亦被證實是心肌纖維化的重要促進因素之一。

Fig 4 Effects of different concentrations ofASTX on Smad3 phosphorylation(A) andnuclear translocation(B) in CFs cells n=8)

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTGF-β1 group

Fig 5 CFs Col Ⅰ and Col Ⅲ mRNA expressioninduced by TGF-β1 via activating Smad3 n=8)

1：TGF-β1+Smad3-siRNA；2：TGF-β1 +ASTX；3：TGF-β1+Smad3-siRNA+ASTX；##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTGF-β1 group;△△P<0.01vsTGF-β1+Smad3-siRNA.

TGF-β1能夠通過上調NOX2和NOX4活性，增強細胞內ROS合成，促進氧化應激反應，加速纖維化進程[9]。本研究結果顯示，TGF-β1+ASTX(5、10、20 μmol·L-1)組ROS合成較ASTX未干預組明顯降低，提示蝦青素干預可以減少TGF-β1誘導的CFs ROS合成，且這種作用呈劑量依賴，這與我們之前的研究結果一致[10]。

新近研究表明，因具有獨特的DNA結合和快速激活區(qū)域，Smad3在心肌纖維化過程的作用被廣泛關注。TGF-β1、血管緊張素II(angiotensin II，AngII)和壓力負荷等常見致心衰因素均能夠誘發(fā)Smad3的磷酸化激活[11]。此外，有研究表明，抑制TGF-β1/Smad3信號通路激活，能夠起到抗心肌纖維化作用[12]。因此，我們亦將研究重點聚焦于Smad3蛋白。本研究結果顯示，ASTX能夠有效抑制TGF-β1誘導的CFs中Smad3的磷酸化。Smad3磷酸化激活后會發(fā)生核轉位，因此，我們又測定了核內的Smad3表達，結果顯示，ASTX能夠明顯抑制TGF-β1誘導的CFs Smad3的核轉位。

Smad3是TGF-β1信號通路的重要下游分子[13]。為了進一步明確Smad3激活與ASTX抑制TGF-β1誘導的CFs中Col Ⅰ和Col Ⅲ表達之間的關系，我們使用了siRNA對Smad3進行基因沉默。結果提示，Smad3-siRNA能夠明顯抑制TGF-β1誘導的CFs Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA表達。Smad3-siRNA聯(lián)用ASTX(20 μmol·L-1)則能夠進一步減少TGF-β1誘導的CFs中Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA表達,產生疊加效果。據(jù)此可知，Smad3激活在TGF-β1誘導的CFs Col Ⅰ和Col Ⅲ表達過程中起到重要作用；ASTX抗纖維化作用可能與其抑制Smad3激活相關。結果提示，下調Smad3的磷酸化水平可能是ASTX抑制TGF-β1誘導的CFs Col Ⅰ、Col Ⅲ的mRNA和蛋白生成的中心環(huán)節(jié)。

綜上所述，ASTX能夠有效抑制TGF-β1誘導的CFs內ROS、Col Ⅰ和Col Ⅲ生成，可能的機制是下調Smad3磷酸化。

(致謝：本課題在鄭州大學第一附屬醫(yī)院重點實驗室完成，感謝實驗的指導老師及各位參與者！)

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