欒家杰，劉 俊，汪 琳，朱艷虹，周德喜，左 堅，徐振宇

(皖南醫(yī)學院 1.弋磯山醫(yī)院藥劑科、2.藥事管理學教研室，安徽 蕪湖 241001)

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT)是體內(nèi)重要第II相生物轉(zhuǎn)化代謝酶，催化葡萄糖醛酸與底物的結(jié)合，將內(nèi)源性和外源性化合物通過膽汁或腎臟排出體外。UGT主要通過UGT基因編碼，該基因可分為UGT1A和UGT2兩個家族[1]。人類UGT1A基因位于染色體2q37，可編碼9種UGT1A酶，其中UGT1A1酶為機體重要的發(fā)揮解毒作用的代謝酶之一，其編碼基因UGT1A1存在遺傳多態(tài)性，是個體間葡萄糖醛酸化活性差異的重要原因之一。其中，UGT1A1*6和UGT1A1*28多態(tài)性與某些藥物療效與不良反應具有密切臨床相關(guān)性，如抗腫瘤藥伊立替康。

伊立替康于1998年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準，用于標準化療方案失敗后的轉(zhuǎn)移性或晚期大腸癌的治療。目前，臨床也用于胃癌、胰腺癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌等的治療，均獲得較為滿意的臨床療效。即使單克隆抗體等靶向制劑在大腸癌的治療中發(fā)揮重要作用[2]，但以伊立替康為基礎的聯(lián)合化療仍是晚期大腸癌首選治療方案，但20%～30%患者可發(fā)生3～4級遲發(fā)性腹瀉和中性粒細胞減少，導致患者生活質(zhì)量下降而延遲治療，嚴重者導致死亡[3]。近年來，UGT1A1基因多態(tài)性與伊立替康不良反應關(guān)聯(lián)性研究成為焦點，也證實了UGT1A1*6和UGT1A1*28與伊立替康不良反應的相關(guān)性[4]。FDA于2005年批準UGT1A1*28基因型用于預測伊立替康不良反應。UGT1A1*28等位基因在非洲人群及西方高加索人群分布頻率分別為12%～27%和5%～15%，亞洲人群中分布僅為1.2%～5.0%[5]；而UGT1A1*6等位基因在亞洲人群中分布頻率可達到13%～23%[6]，為亞洲人所特有的突變型。因此，UGT1A1*6基因多態(tài)性分布可能對預測亞洲人群使用伊立替康后發(fā)生相關(guān)不良反應的風險更具有臨床實用價值。通過對基因組學等的研究和轉(zhuǎn)化，對腫瘤患者實施個體化的精準醫(yī)療[7]。本文通過對來自安徽省多家醫(yī)療機構(gòu)送檢的腫瘤患者的血液樣本進行UGT1A1*6基因檢測，以了解UGT1A1*6基因在安徽地區(qū)漢族人群腫瘤患者中多態(tài)性分布情況，為臨床預測伊立替康毒性風險提供參考，并為臨床實施伊立替康個體化治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標本來源血液標本主要來源于安徽省第二人民醫(yī)院、安徽省腫瘤醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、合肥市濱湖醫(yī)院、合肥市第二人民醫(yī)院、合肥市第三人民醫(yī)院、解放軍第105醫(yī)院、中鐵四局集團中心醫(yī)院、蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院、蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院、懷遠縣人民醫(yī)院、亳州市人民醫(yī)院、滁州市第一人民醫(yī)院、皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院、蕪湖市第二人民醫(yī)院、寧國市人民醫(yī)院、宣城市人民醫(yī)院、馬鞍山市人民醫(yī)院、銅陵市人民醫(yī)院、阜陽市人民醫(yī)院、安慶海軍116醫(yī)院等20家醫(yī)療機構(gòu)2014年4月～2016年12月期間送檢的222例漢族腫瘤患者。本研究方案經(jīng)過皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會倫理審查并批準(編號：2014倫審新第25號)。

1.2儀器與試劑L998A型熒光檢測儀(西安天隆科技有限公司)。核酸純化試劑，商品名：耀金保，主要成分為60%聚乙二醇200、20 mmol·L-1氫氧化鉀和去離子水，第一類體外診斷試劑產(chǎn)品備案號：京大械備20150010號，北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；基因檢測通用試劑，商品名：耀金分，主要成分為20 mmol·L-1三羥甲基玩基甲烷-鹽酸緩沖液、50 mmol·L-1氯化鉀、1.5 mmol·L-1氯化鎂、0.1%吐溫20、0.01%牛血清白蛋白、5 mmol·L-1磷酸、寡核苷酸、1 U KOD DNA聚合酶、200 mmol·L-1三磷酸堿基脫氧核苷酸，第一類體外診斷試劑產(chǎn)品備案號：京大械備20150009號，北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；10×氯化銨溶液(北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)。

1.3UGT1A1*6基因分型選用乙二胺四乙酸二鈉抗凝采血真空管采集患者外周靜脈血2～3 mL，采用熒光染色原位雜交分析技術(shù)對患者血液標本進行基因型檢測。具體操作步驟：10×氯化銨溶液與滅菌水按1: 9比例稀釋為工作液備用；在滅菌的1.5 mL離心管中加入1 mL工作液，取200 μL混勻的待檢全血抗凝標本加入離心管中，顛倒混勻，室溫靜置5 min后，以3 000 r·min-1離心5 min；棄上清，離心管底部可見白色米粒大小白細胞沉淀；在白細胞沉淀中加入100 μL核酸純化試劑，吹打混勻后，室溫靜置30 min，得到白細胞混懸液；吸取1.5 μL白細胞混懸液，加入相應測序反應通用試劑中，蓋緊管帽，置入檢測設備熒光檢測儀中，打開熒光染色原位雜交分析系統(tǒng)，選擇待檢測的基因類型，運行設備進行檢測；采用熒光染色原位雜交分析系統(tǒng)自動判讀熒光信號值，獲取熒光曲線圖，進行UGT1A1*6基因分型，并作陽性質(zhì)控。

2 結(jié)果

2.1患者一般情況特征送檢的222例腫瘤患者中，男性154例(占69.37%)，女性68例(占30.63%)；患者年齡21～89歲，平均(59.41±11.41)歲，其中結(jié)直腸癌116例、肺癌59例、胃癌17例、食道癌8例、其他類型腫瘤22例(其中乳腺癌7例、卵巢癌5例、十二指腸癌5例、子宮內(nèi)膜癌2例、膽囊癌2例、胰腺癌1例)。

2.2UGT1A1*6基因型分布UGT1A1*6依據(jù)基因型不同分為野生型*1/*1(或GG)、突變雜合型*1/*6(或GA)及突變純合型*6/*6(AA)，其代表性熒光曲線圖見Fig 1。送檢的222例腫瘤患者樣本中，UGT1A1*6野生型*1/*1(GG)159例次，占總例次71.62%，突變雜合型*1/*6(GA)52例次，占23.42%，及突變純合型*6/*6(AA)11例次，占4.96%。G等位基因分布頻率為83.33%，UGT1A1*6突變率為16.67%，且基因分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，達到遺傳平衡，具有群體代表性(Tab 1)。

Tab 1 Distribution of UGT1A1*6 gene polymorphisms and alleles in 222 cancer patients

Fig 1 Representative fluorescence graphs of different UGT1A1*6 genotypes

2.3不同臨床特征腫瘤患者UGT1A1*6基因型和等位基因分布情況通過比較UGT1A1*6基因型和等位基因在不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位以及地區(qū)來源中分布發(fā)現(xiàn)，UGT1A1*6基因型分布和等位基因分布頻率與患者性別和年齡無相關(guān)性，但在腫瘤發(fā)生部位及地區(qū)來源方面差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見Tab 2、3。

Tab 2 Comparison of distribution of UGT1A1*6 genotype in 222 cancer patients with different clinical features

Tab 3 Comparison of distribution frequency of UGT1A1*6 allelic genes in 222 cancer patients with different clinical features

3 討論

伊立替康是一種無活性前體藥，在人體內(nèi)經(jīng)羧酸酯酶2(carboxylesterase-2，CES2)的活化，轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚源x產(chǎn)物7-乙基-10羥基-喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN-38)。SN-38為DNA拓撲異構(gòu)酶I(topoisomerase 1，Top1)抑制劑，通過抑制人體細胞DNA復制所需的Top1，誘導DNA單鏈損傷，阻斷DNA復制而產(chǎn)生細胞毒性作用。SN-38主要在肝臟內(nèi)經(jīng)UGT1A1酶滅活成葡萄糖醛酸化SN-38(SN-38 glucuronide，SN-38G)，經(jīng)膽汁排入腸道，在腸道β-葡萄糖醛酸酶作用下轉(zhuǎn)化為SN-38，引發(fā)腸黏膜損傷及遲發(fā)性腹瀉。伊立替康所致遲發(fā)性腹瀉為劑量限制性，一般發(fā)生在用藥后d 5，其發(fā)生率約20%。此外，伊立替康在殺傷腫瘤細胞同時，也損傷患者正常細胞，尤其是導致中性粒細胞減少，一般發(fā)生在用藥后的d 8。法國有研究采用FOLFIRI方案(伊立替康+四氫葉酸鈣+氟尿嘧啶)治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，當伊立替康劑量達到260 mg·m-2，3～4級中性粒細胞減少的發(fā)生率為61%，腹瀉發(fā)生率為18%[8]。

目前研究認為，伊立替康相關(guān)不良反應的發(fā)生與UGT1A1基因多態(tài)性密切相關(guān)，其中研究較多的為UGT1A1*6和UGT1A1*28單核苷酸多態(tài)性，該基因多態(tài)性可導致SN-38葡萄糖醛酸化速率最多可產(chǎn)生50倍差異。對于攜帶突變型等位基因的個體，UGT1A1酶活性下降，使得其對SN-38葡萄糖醛酸化能力減弱，引起SN-38體內(nèi)蓄積，從而導致嚴重毒性反應。UGT1A1*28突變純合型對SN-38的葡萄糖醛酸化的活性僅為野生型的35%[9]。研究表明[10]，UGT1A1*28純合突變型患者中性粒細胞減少發(fā)生率分別較野生型和雜合突變型患者增加4倍和3倍，腹瀉發(fā)生率增加2倍。FDA規(guī)定，對于UGT1A1*28突變純合子個體在使用伊立替康時，應根據(jù)患者具體情況降低劑量，以減少藥品不良反應的發(fā)生。由于亞洲人群UGT1A1*28 分布頻率較低，約為1.2%～5.0%，故沒有足夠證據(jù)證明UGT1A1*28亞洲人群使用伊立替康發(fā)生毒性之間的關(guān)系。日本1項針對宮頸癌或卵巢癌患者研究結(jié)果表明[11]，攜帶UGT1A1*6突變等位基因患者發(fā)生3～4級中性粒細胞減少、血小板減少和腹瀉的比例均明顯升高。Gao等[12]在中國食管癌和胃癌患者中研究表明，UGT1A1*6突變型與3～4級中性粒細胞減少存在相關(guān)性。Meta分析結(jié)果表明，UGT1A1*6突變型患者使用中高劑量伊立替康時發(fā)生3～4級中性粒細胞減少風險明顯增加[13]。UGT1A1*6突變型可使UGT1A1酶的葡萄糖醛化能力下降70%。藥物基因組學知識數(shù)據(jù)庫(pharmacogenomics knowledge base , Pharm GKB)推薦，伊立替康給藥劑量大于250 mg·m-2的患者，UGT1A1*28攜帶者應減少30%劑量，而劑量低于250 mg·m-2者，則不用下調(diào)劑量。然而，國內(nèi)伊立替康給藥劑量相對減低，通常為125 mg·m-2或120 mg·m-2，或者更低，而UGT1A1*6基因突變與使用60 mg·m-2以上劑量伊立替康發(fā)生不良反應相關(guān)，能夠更好預測中國人群采用較低劑量伊立替康發(fā)生不良反應的風險。因此，研究UGT1A1*6在中國區(qū)域人群中多態(tài)性分布，從而篩查風險人群，實施個體化治療方案，具有重要臨床意義。

UGT1A1*6存在明顯種族及區(qū)域分布差異。UGT1A1*6目前僅在亞洲人群中發(fā)現(xiàn)，其分布頻率約為13%～23%[6]，其漢族隨機人群中突變頻率約為45%。吳窮等[14]在皖北地區(qū)人群中研究發(fā)現(xiàn)，UGT1A1*6野生型(GG)、突變雜合型(GA)和突變純合型(AA)發(fā)生頻率分別為73.7%、21.1%和5.3%，UGT1A1*6突變率為15.79%。本研究通過對來自安徽省不同地區(qū)的漢族人群進行UGT1A1*6基因檢測，結(jié)果表明，222例送檢腫瘤患者中，GG型占71.62%，GA型為23.42%，AA型4.96%，A等位基因發(fā)生頻率為16.67%，與文獻報道[14]相似。來向陽等[15]研究認為，男性、<40歲、腸道、山東地區(qū)、甘肅地區(qū)腫瘤患者UGT1A1*6基因型分布差異有統(tǒng)計學意義。本研究發(fā)現(xiàn)， UGT1A1*6在食道癌患者中突變率43.75%，明顯高于其他部位腫瘤患者(P=0.001)，且在馬鞍山及滁州地區(qū)突變率分別為40.01%和34.62%，明顯高于其他地區(qū)來源的患者(P=0.004)。因此，UGT1A1*6基因分型基礎上，還要關(guān)注患者腫瘤發(fā)生部位及地區(qū)來源。

綜上所述，本研究選取了來自安徽不同地區(qū)腫瘤患者資料，且選取的樣本達到遺傳平衡，基本能夠反映UGT1A1*6在安徽地區(qū)漢族人群中的多態(tài)性分布。通過初步了解UGT1A1*6在安徽地區(qū)漢族人群中分布頻率，為伊立替康實施個體化治療提供用藥參考。但本研究仍存在一定不足，如沒有進一步闡明UGT1A1*6基因多態(tài)性與伊立替康不良反應的關(guān)聯(lián)性，且由于納入的樣本量有限，可能在統(tǒng)計上存在偏倚。此外，隨著對伊立替康不良反應相關(guān)基因多態(tài)性研究的深入，羧酸酯酶、細胞色素P450 3A4、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等基因多態(tài)性與伊立替康不良反應發(fā)生的關(guān)聯(lián)性也逐漸被揭示。除了遺傳因素外，患者年齡、性別、合并用藥及生活習慣等非遺傳因素均可能影響伊立替康不良反應的發(fā)生。因此，大樣本、多因素聯(lián)合研究對于預測伊立替康不良反應發(fā)生風險顯得尤為重要，以期提高患者臨床療效，降低患者用藥風險，實施臨床個體化治療。

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