辛順佳， 楊虹琦， 熊 偉， 楊俊興， 楊紅武， 嚴(yán)永旺

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128)

近年來，我國化學(xué)除草劑用量和使用面積呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。據(jù)全國農(nóng)技推廣中心統(tǒng)計(jì)，2009年全國雜草發(fā)生面積0.89億hm2，化學(xué)防除面積達(dá)0.91億hm2，挽回糧食損失 2 141萬t[1]。由于化學(xué)除草劑具有速度快、防效好、省力、省工等優(yōu)點(diǎn)，因此被農(nóng)民廣泛使用。研究表明，這些除草劑有70%會(huì)進(jìn)入土壤[2]，并且對(duì)土壤微生物的活動(dòng)產(chǎn)生影響[3-4]，進(jìn)而影響土壤中有機(jī)物質(zhì)的分解速度。微生物是土壤有機(jī)物質(zhì)的最早來源，雖然土壤中微生物數(shù)量占有機(jī)物質(zhì)總量的比例很少，但它們對(duì)土壤有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化起著非常重要的作用。土壤有機(jī)物質(zhì)是指那些進(jìn)入土壤中尚未被微生物分解的動(dòng)植物殘?bào)w，其中含氮化合物主要是由各種氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，并且大部分蛋白質(zhì)須要經(jīng)過微生物分泌產(chǎn)生的蛋白酶作用才能被分解和利用。因此，土壤中產(chǎn)蛋白酶微生物的種群結(jié)構(gòu)、數(shù)量及其分泌蛋白酶活性與土壤有機(jī)物質(zhì)中蛋白質(zhì)的分解速度密切相關(guān)，并且在一定程度上可以反映土壤有機(jī)質(zhì)礦化的速率[5-6]。對(duì)湖南省煙稻輪作地區(qū)耕層土壤養(yǎng)分調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其土壤有機(jī)質(zhì)有逐年升高的趨勢(shì)，雖然有關(guān)除草劑對(duì)土壤微生物群落影響的相關(guān)研究報(bào)道較多[7-9]，但未見針對(duì)湖南省煙稻輪作地區(qū)耕層土壤分離的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌種屬及其分泌蛋白酶活性研究的報(bào)道。本試驗(yàn)選取生產(chǎn)上廣泛使用且作用機(jī)制不同的3種除草劑(二甲戊靈、異丙甲草胺和精喹禾靈)為試驗(yàn)材料，系統(tǒng)研究了土壤中分離的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌種屬及不同除草劑對(duì)細(xì)菌蛋白酶活性的影響，為探明湖南省煙稻輪作地區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)逐年升高與大量使用化學(xué)除草劑是否有關(guān)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 供試高有機(jī)質(zhì)土壤樣品采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園(YY)、湖南省寧鄉(xiāng)縣橫市鎮(zhèn)(NX)、湖南省邵陽市橫板橋鄉(xiāng)(SY)。經(jīng)檢測(cè)已知耘園土壤有機(jī)質(zhì)平均含量為 25.92 g/kg，寧鄉(xiāng)土壤有機(jī)質(zhì)平均含量為33.29 g/kg，邵陽土壤有機(jī)質(zhì)平均含量為40.83 g/kg。

1.1.2 供試除草劑 供試除草劑為33%二甲戊靈乳油、720 g/L 異丙甲草胺乳油和10%精喹禾靈乳油，均由市場(chǎng)采購。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)酪素培養(yǎng)基。KH2PO40.360 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，ZnCl20.014 g，Na2HPO4·7H2O 1.070 g，NaCl 0.160 g，CaCl20.002 g，F(xiàn)eSO40.002 g，干酪素4.000 g，瓊脂20.000 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0～7.2。(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 L，pH值為7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 土壤產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離純化 稱取5 g清除殘根雜物的土壤樣品，倒入含有45 mL無菌水的150 mL錐形瓶中，振蕩20 min，使土樣充分打散，即成為10-1的土壤懸液。用移液槍吸10-1的土壤懸液1 mL，放入9 mL無菌水中即為10-2稀釋液，如此重復(fù)，依次制成10-3、10-4、10-5的稀釋液，分別涂布于酪素培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)2 d后，挑取產(chǎn)生蛋白水解圈的菌落，進(jìn)一步劃線直到得到單菌落，對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，斜面保存，置于4 ℃冰箱中。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的初篩 將分離純化得到的菌種接種到酪素培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑選生長良好、蛋白水解圈明顯較大且透明度高的單菌落，測(cè)量其水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)。

1.2.3 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的復(fù)篩 在250 mL錐形瓶中加入液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌30 min，將初篩得到的菌株分別接種于培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，離心培養(yǎng)液，取上清液1 mL測(cè)蛋白酶活性。從每份土壤中選擇形態(tài)各不相同且酶活性最高的1株細(xì)菌作為不同劑量除草劑對(duì)細(xì)菌及其分泌蛋白酶活性影響的試驗(yàn)菌株。

1.2.4 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌種屬鑒定

1.2.4.1 形態(tài)觀察和生理生化鑒定 在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[11]對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶、甲基紅、硝酸鹽還原、淀粉水解、葡萄糖發(fā)酵、V-P試驗(yàn)等生理生化鑒定。

1.2.4.2 16S rRNA基因測(cè)序 委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行菌株的16S rRNA基因測(cè)序，所得結(jié)果在 GenBank 中進(jìn)行Blast搜索同源序列，并利用Mega 5.0軟件進(jìn)行同源性分析以確定菌種。

1.2.5 除草劑對(duì)細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶活性的影響 將已鑒定出的細(xì)菌以1%的接種量接種到酪素體培養(yǎng)基中，加入不同濃度的除草劑。其中，二甲戊靈使用濃度為0.099、0.198、0.396、0.792、1.584 mg/mL，異丙甲草胺使用濃度為0.36、0.72、1.44、2.88、5.76 mg/mL，精喹禾靈使用濃度為0.033、0.066、0.132、0.264、0.528 mg/mL；以不加除草劑的酪素體培養(yǎng)基為對(duì)照。37 ℃搖床培養(yǎng)48 h，離心培養(yǎng)液，取上清液測(cè)蛋白酶活性和游離氨基酸含量。

1.2.6 蛋白酶活性測(cè)定 取5 mL 0.6%酪蛋白溶液于試管中，40 ℃預(yù)熱2 min后加19 mL pH值為8的硼酸緩沖液和 1 mL 酶液，40 ℃水浴反應(yīng)10 min，再加5 mL 0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，40 ℃保溫20 min，沉淀殘余底物并過濾，濾液在275 nm下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。以先加三氯乙酸使酶失活的試管為空白對(duì)照，以1 min內(nèi)由酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在275 nm處的吸光度與1 μg的酪氨酸相當(dāng)時(shí)，其所需的酶量為1個(gè)單位，單位為U/mL。

1.2.7 游離氨基酸含量測(cè)定 采用茚三酮顯色法測(cè)定[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌篩選

從3份供試土壤中共計(jì)篩選出37株產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，菌種編號(hào)、透明圈直徑與菌落直徑之比及細(xì)菌蛋白酶活性的測(cè)定結(jié)果見表1。根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑之比及蛋白酶活性，選擇蛋白酶活性較高的YY-4、NX-3和SY-2菌株進(jìn)行生理生化特性及16S rRNA基因分析和鑒定。但通過觀察發(fā)現(xiàn)，YY-4和SY-2菌落形態(tài)相似，因此SY地點(diǎn)選用 SY-9 菌株進(jìn)行試驗(yàn)。YY-4菌株蛋白酶活性最高，其次為NX-3菌株，SY-9菌株蛋白酶活性最小。

表1 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌篩選結(jié)果

2.2 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌鑒定

2.2.1 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌形態(tài)與生理生化特性 YY-4菌落為乳白色、圓形突起、表面光滑、白蠟狀；NX-3菌落顏色為乳白色偏黃、圓形、表面光滑、濕潤；SY-9菌落為乳黃色、不規(guī)則形蔓延、半透明、表面光滑、濕潤。3株產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌主要生理生化指標(biāo)分析結(jié)果見表2。3種細(xì)菌的革蘭氏染色、接觸酶、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)酸和葡萄糖產(chǎn)氣特性均相同，但甲基紅顯色、淀粉水解和V-P特性有所不同。

注：“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)。

2.2.2 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌16S rRNA基因鑒定 3種細(xì)菌16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖1。經(jīng)測(cè)序得到的16S rRNA基因序列長度分別為YY-4長1 496 bp；NX-3長 1 496 bp；SY-9長1 492 bp。將得到的基因序列與Blast、GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，并利用Mega 5.0軟件進(jìn)行同源性分析，根據(jù)細(xì)菌鑒定中核糖體基因16S區(qū)域同源性大于99%可視為同一個(gè)種屬的準(zhǔn)則，確定菌株YY-4為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)；NX-3菌株為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)；SY-9菌株為短小芽孢桿菌(B.pumilus)。

2.3 除草劑對(duì)3種細(xì)菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響

2.3.1 二甲戊靈對(duì)3種細(xì)菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響 二甲戊靈通常作為芽前、芽后旱田土壤除草劑[13]，廣泛應(yīng)用于玉米、大豆、馬鈴薯、煙草、蔬菜等田地除草。二甲戊靈對(duì)3種細(xì)菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響見圖2、圖3。結(jié)果顯示，二甲戊靈濃度低于 0.198 mg/mL 時(shí)，對(duì)蠟樣芽孢桿菌和NX-3菌株蛋白酶活性無抑制作用，但對(duì)短小芽孢桿菌蛋白酶活性有抑制作用；當(dāng)二甲戊靈濃度超過0.198 mg/mL后，3種菌株產(chǎn)蛋白酶活性均迅速下降。蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液中氨基酸含量的變化與蛋白酶活性變化基本一致，但在低濃度的二甲戊靈中，NX-3菌株和短小芽孢桿菌培養(yǎng)液的氨基酸含量持續(xù)下降。由此可見，二甲戊靈對(duì)短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和NX-3菌株產(chǎn)蛋白酶活性均有抑制作用，并且低濃度的二甲戊靈(超過 0.198 mg/mL時(shí))對(duì)短小芽孢桿菌、 NX-3 菌株的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制作用相對(duì)較弱。

2.3.2 異丙甲草胺對(duì)3種細(xì)菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響 異丙甲草胺是一種選擇性苗前使用的土壤除草劑[14]，可用于棉花、花生、馬鈴薯、煙草等田地除草。異丙甲草胺對(duì)3種細(xì)菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響見圖4、圖5。異丙甲草胺濃度低于0.36 mg/mL時(shí)，對(duì)蠟樣芽孢桿菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量均無抑制作用，但對(duì)NX-3菌株和短小芽孢桿菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量有一定的抑制作用；異丙甲草胺濃度超過0.36 mg/mL后，蠟樣芽孢桿菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量均急速下降。說明當(dāng)異丙甲草胺濃度超過0.36 mg/mL后對(duì)3種細(xì)菌蛋白酶活性都有較強(qiáng)的抑制作用。

2.3.3 精喹禾靈對(duì)3種細(xì)菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響 精喹禾靈是一種新型的芳基苯氧基丙酸類除草劑[15]，可用于大豆、煙草、棉花、花生、油菜等田地除草。精喹禾靈對(duì)3種細(xì)菌蛋白酶活性及細(xì)菌培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響見圖6、圖7。結(jié)果表明，低濃度的精喹禾靈對(duì)蠟樣芽孢桿菌、NX-3菌株、短小芽孢桿菌蛋白酶活性和培養(yǎng)液中氨基酸含量都有很強(qiáng)的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

前人研究結(jié)果表明，2，4-D[3]、阿特拉津[4]、草甘膦[8]、芐嘧磺隆[9]等除草劑會(huì)影響土壤細(xì)菌的數(shù)量；甲磺隆的施入不僅會(huì)影響微生物生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)，而且對(duì)土壤微生態(tài)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生一定的破壞作用[16]。滕春紅等的研究表明，氟磺胺草醚對(duì)土壤蛋白酶活性表現(xiàn)出抑制作用，低濃度(5、10 μg/kg)的氯嘧磺隆對(duì)蛋白酶活性有輕微的激活作用，而高濃度(20、100 μg/kg)的氯嘧磺隆對(duì)蛋白酶活性有抑制作用[17-18]。本試驗(yàn)研究了二甲戊靈、異丙甲草胺、精喹禾靈這3種除草劑，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诘蜐舛葧r(shí)均對(duì)蠟樣芽孢桿菌、NX-3菌株、短小芽孢桿菌的蛋白酶活性有明顯的抑制作用。但由于這3種除草劑的作用機(jī)制各不相同，所以相同條件下對(duì)不同細(xì)菌蛋白酶活性的影響略有不同。

土壤蛋白酶是土壤氮素礦化過程中的重要水解酶，其酶活性在一定程度上可以反映土壤中分泌蛋白酶細(xì)菌的數(shù)量，也可以反映土壤氮素礦化的速率。Kamimura等研究表明，蛋白酶與全氮礦化速率呈顯著正相關(guān)關(guān)系[6]。因此，揭示不同除草劑對(duì)細(xì)菌蛋白酶活性的影響將為除草劑對(duì)土壤礦化速率影響的研究奠定堅(jiān)實(shí)的理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。本試驗(yàn)僅以高有機(jī)質(zhì)土壤中分離出的3種產(chǎn)蛋白酶活性較高的細(xì)菌為供試對(duì)象，研究除草劑二甲戊靈、異丙甲草胺、精喹禾靈對(duì)細(xì)菌蛋白酶活性的影響，而這3種除草劑是否對(duì)細(xì)菌分泌的其他水解酶或氧化酶活性有抑制作用還有待今后做進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]張宏軍，劉 學(xué)，沙虎全，等. 我國除草劑登記使用現(xiàn)狀及存在問題[J]. 雜草學(xué)報(bào)，2011，29(1)：7-11.

[2]陸貽通，朱有為. 基本農(nóng)田保護(hù)區(qū)域的環(huán)境污染及防治對(duì)策[J]. 上海環(huán)境科學(xué)，1995，14(8)：45-46.

[3]韓麗珍，趙德剛. 除草劑2，4-D脅迫對(duì)土壤微生物的影響研究[J]. 土壤通報(bào)，2013，44(4)：974-979.

[4]姚 斌，徐建民，尚 鶴，等. 阿特拉津除草劑對(duì)土壤微生物生態(tài)特征的影響[J]. 水土保持學(xué)報(bào)，2005，19(3)：46-49.

[5]蔡 紅，沈仁芳. 改良茚三酮比色法測(cè)定土壤蛋白酶活性的研究[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2005，42(2)：306-313.

[6]Kamimura Y，Hayano K. Properties of protease extracted from tea-field soil[J]. Biology & Fertility of Soils，2000，30(4)：351-355.

[7]宿翠翠，李 瑋，郭青云. 除草劑對(duì)馬鈴薯土壤中細(xì)菌、放線菌群落的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43(12)：96-101.

[8]陶 波，蔣凌雪，沈曉峰，等. 草甘膦對(duì)土壤微生物的影響[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2011，33(2)：162-168.

[9]趙 蘭，黎華壽. 四種除草劑對(duì)稻田土壤微生物類群的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27(2)：508-514.

[10]東秀珠，妙 英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2002.

[11]黃秀梨，辛明秀. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，2008：48-51.

[12]劉 美，馬葉萍，柳陽陽，等. 茶葉中游離氨基酸含量的測(cè)定[J]. 微量元素與健康研究，2016，33(1)：51-52.

[13]金 前，賈會(huì)娟，李雪玲，等. 二甲戊靈脅迫下的土壤酶活性變化[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，52(5)：889-894.

[14]劉少平. 異丙甲草胺在煙田的殘留降解行為和效應(yīng)研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[15]周麗興，萬樹青，陳澤鵬，等. 短小芽孢桿菌(Bacilluspumilis)對(duì)精喹禾靈的降解特性[J]. 農(nóng)藥，2006，45(9)：627-629.

[16]郭梅燕. 兩種長殘留除草劑土壤降解動(dòng)態(tài)及對(duì)土壤酶的影響[D]. 新鄉(xiāng)：河南科技學(xué)院，2014.

[17]滕春紅，陶 波. 除草劑氯嘧磺隆對(duì)土壤酶活性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25(5)：1294-1298.

[18]姚 斌，汪海珍，徐建民，等. 除草劑對(duì)水稻土微生物的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(2)：349-354.