楊總應， 蔣向輝

(凱里學院化學與材料工程學院，貴州凱里 556011)

金銀花(Lonicerajaponica)別稱忍冬，2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定其為忍冬科忍冬屬忍冬干燥花蕾或帶初開的花[1]。金銀花原產于我國山東、河北、河南等省，近年來在湖南、貴州、四川等省均有引種栽培。金銀花性味甘寒，具有清熱解毒、去風熱等功效，近年來研究發(fā)現，金銀花在降血脂、調節(jié)人體免疫與抗病毒方面有特殊的療效[2]。隨著以金銀花為主要原料的一系列藥用與保健產品的開發(fā)，金銀花的市場價值越來越重要。金銀花含有140多種化合物，揮發(fā)油類、綠原酸類、黃酮類、三萜類是其主要成分，其中黃酮類化合物有木犀草素-7-O-α-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷、5-羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷等[3-4]。

筆者所在實驗室曾以金銀花為試驗材料，采用差異表達的方法克隆得到LjFNS基因的中間序列(GenBank登錄號JQ716370.1)，測序后利用美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information，簡稱NCBI)的Blast分析軟件進行序列相似性搜索，發(fā)現該序列與擬南芥基因組中的細胞色素P450基因的序列相似。為了進一步研究該基因在金銀花生長發(fā)育中的功能，本研究采用染色體步移方法，以金銀花為試驗材料，克隆得到該基因的基因組序列和編碼序列(coding sequence，簡稱CDS)，在對序列進行生物信息學分析的基礎上，采用實時熒光定量PCR(qPCR)的方法分析LjFNS在金銀花莖、葉與花等不同組織以及幼葉、老葉、白花與黃花等不同發(fā)育時期的表達特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗中采用的金銀花采自懷化學院藥用植物園，金銀花植株于2012年引自河南省新鄉(xiāng)市，經懷化學院劉光華教授鑒定為忍冬屬植物金銀花。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組序列的克隆 參照蔣向輝等關于植物葉片DNA提取的改良CTAB法[5]提取金銀花總DNA，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。用4種不同的限制性內切酶(AatⅡ、BamH Ⅰ、ClaⅠ、FseⅠ，購自美國NEB公司)酶切基因組DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。酶切產物采用DNA回收試劑盒進行回收純化，在回收的DNA片段兩頭分別接上接頭AD1(5′-GATCCGAGTGGCTTACAGCGATAG CGGATGACGGGACAGGTAGCTAATA-3′)和AD2(3′-H2N-CGGCTTGT-PO4-5′)，構建4種不同酶切產物的Genome Walker DNA文庫，分別命名為FNS-1、FNS-2、FNS-3和FNS-4。分別以4個不同的文庫DNA為模板，進行巢式PCR擴增，第1輪PCR引物為接頭引物AP1(5′-CTGCCGAGTGGCTTAGGCCAGT-3′)與特異性引物GSP1(L1：5′-AGGTTGCCGTTAGTTCCGGATTTGATT-3′和R1：5′-TCGCCGTGACCGGATGGTCGAAGTAGCT-3′)，PCR擴增程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，67 ℃ 5 min，29個循環(huán)；67 ℃延伸5 min。用DNA回收試劑盒回收第1輪PCR產物，稀釋50倍后，以此為模板進行第2輪PCR擴增，擴增引物為接頭引物AP2(5′-TTACGGCTGATGGC TTTGA-3′)與特異性引物GSP2(L2：5′-GTACGTGATT AGCCAGTAGGACGTGGA-3′和R2：5′-TTGCAGGGTCA GGTAAAGTGTGGTACG-3′)，PCR擴增程序：94 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 45 s，65 ℃ 3 min，21個循環(huán)；65 ℃ 延伸5 min。同樣采用DNA提取試劑盒回收第2輪PCR產物，將回收片段連接至T載體后送上海伯豪生物技術有限公司進行測序，將測序所得DNA序列提交至NCBI數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行序列比對并拼接，以拼接DNA序列為參考，設計LjFNS基因全長克隆引物LjFNS-F(5′-ATGTCTTGGCTTTATCTTTTAGACA-3′)、LjFNS-R(5′-AATACGATAGAATGCGGAACTCG-3′)，進一步以金銀花總DNA為模板擴增LjFNS基因全長序列。

1.2.2 編碼序列預測與克隆 利用NCBI中的Blast分析軟件，對克隆得到的LjFNS基因組序列進行比對，對編碼序列進行預測。以金銀花初開的花為材料，采用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒提取金銀花總RNA，并逆轉錄合成cDNA第1鏈，以cDNA為模板，用引物LjFNSF(5′-ATGTCTTGGCTTTA TCTTTTAGACA3′)、LjFNSR(5′-UUAACGATAGAATGCG GAACTAG-3′)對LjFNS基因的CDS全長進行克隆。

1.2.3 生物信息學分析 用DNAMAN軟件與GENEDOC軟件相結合進行LjFNS基因DNA序列的組成分析以及與相似基因的同源性比對分析。采用Protparam在線數據庫預測LjFNS基因編碼蛋白的氨基酸序列、分子量、等電點、穩(wěn)定性和親水性等理化性質；采用SignalP在線軟件進行蛋白質的信號肽分析；采用Wolfpsort在線數據庫進行LjFNS基因編碼蛋白的亞細胞定位預測；采用TMHMM在線軟件進行LjFNS基因編碼蛋白跨膜結構域與功能域的分析。

1.2.4 組織表達特異性分析 采用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒分別提取金銀花幼葉、老葉、幼莖、綠蕾、白花和黃花的總RNA，并進行逆轉錄合成cDNA，用于實時熒光定量PCR分析。檢測LjFNS基因表達的定量PCR引物為LjFNS-Q-F(5′-CGTACTCAAACTCACCGAAAG-3′)和LjFNS-Q-R(5′-GCATTCAATTGCTGTTCTCCTGT-3′)。以苜蓿β-Actin基因為內參，定量PCR引物為Actin-F(5′-AGGGAGTCGTGAAAGGTTGTC-3′)和Actin-R(5′-TTCCTGGTCTCGTAGTAGAGTTCG-3′)。采用購自TaKaRa公司的SYBR Premix ExTaqTM試劑盒，將各組織的cDNA稀釋適當倍數(通常為100 ng/μL以下)作為模板，使用Mx3000P(Stratagene)熒光定量PCR儀進行qPCR反應，反應體系總體系為25 μL，其中SYBR Premix ExTaqTM(5×)5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ(10×)2.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA1 μL，ddH2O 16.5 μL，反應程序為95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38個循環(huán)。qPCR檢測重復5次，采用Mx3000P軟件對結果進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 LjFNS基因全長序列的克隆

采用上游特異引物GSP1與接頭引物AP1、下游特異引物GSP2與接頭引物AP2，分別以4個酶切產物DNA文庫為模板進行巢式PCR擴增，用文庫FNS-1能擴增出上游的清晰條帶，用文庫FNS-2能擴增出下游的清晰條帶(圖1-a)?；厥占兓疨CR產物，利用特異引物GSP2和接頭引物AP2進行測序。將克隆到的上游片段稱為FNS-F，下游片段稱為FNS-R，并將這2個DNA序列提交到NCBI數據庫進行序列比對分析，其中下游片段與金銀花LjFNS基因的中間序列(GenBank登錄號：JQ716370.1)有重疊，隨后將FNS-F、FNS-R與LjFNS基因的中間序列進行序列拼接，并將拼接結果在NCBI中進行序列比對，結果顯示，此拼接序列與LOC9307309基因序列相似度達89%，推測此序列編碼的基因可能是與擬南芥LOC9307309同源的基因，將其命名為LjFNS。

根據拼接序列設計得到LjFNS基因全長引物LjFNSF與LjFNSR，以金銀花基因組DNA為模板，克隆得到1個全長為1 701 bp的序列(圖1-b)，其與拼接結果一致，證明克隆到的是金銀花LjFNS基因全長序列。隨后以金銀花cDNA為模板，利用引物LjFNSF與LjFNSR進行擴增。對擴增片段進行測序，結果表明，PCR擴增到的目的片段含有1 593 bp完整開放閱讀框(ORF)，比其基因組序列少1段108 bp的內含子序列。此外，氨基酸序列相似度達89%。隨后，利用GENEDOC多序列比對與分析軟件對LjFNS與LOC9307309的CDS序列和氨基酸序列進行比對，由圖2可以看出，LjFNS與LOC9307309的編碼序列高度相似，推測LjFNS與LOC9307309是同源基因。

2.2 LjFNS基因生物信息學分析

利用NCBI中的Blast分析軟件，對克隆得到的LjFNS基因組序列進行比對，結果顯示，該基因組全長為1 701 bp，有2個內含子和3個外顯子，編碼序列長1 593 bp，編碼530個氨基酸。LjFNS編碼蛋白的理化性質預測顯示，其蛋白序列長度為530個氨基酸，分子式為C2 676H4 223N737O735S25，含纈氨酸(Val)最多，占比達12.1%，不含吡咯賴氨酸(Pyl)、酪氨酸(Tyr)(表1)，等電點(pI)為9.03，分子量為58.036 8 ku，其不穩(wěn)定性系數為37.11(<50.00)，通常歸于穩(wěn)定性蛋白一類，氨基酸殘基側鏈帶完全正電荷的賴氨酸、精氨酸與組氨酸總和為69個，氨基酸殘基側鏈帶完全負電的谷氨酸與天冬氨酸總和為54個，蛋白帶正電荷，為堿性蛋白質。脂肪族氨基酸指數為57.49，芳香族氨基酸與雜環(huán)族氨基酸指數的總和為87.49，多環(huán)類氨基酸較多，這可能與其催化黃酮類物質的合成功能有關。LjFNS蛋白親水性系數為 -0.062，該蛋白歸于疏水性蛋白一類。用SignalP在線軟件對LjFNS蛋白的信號肽分析發(fā)現，該蛋白中膜錨定信號較強，該蛋白屬于膜蛋白。采用Wolfpsort在線軟件對LjFNS蛋白進行亞細胞定位分析結果顯示，該蛋白定位于葉綠體膜、內質網膜和液泡膜。采用TMHMM在線分析發(fā)現，LjFNS蛋白具有跨膜結構域，其跨膜區(qū)域定位于第112～138位氨基酸區(qū)域，而第17～32位氨基酸定位于膜內區(qū)域，其余氨基酸定位于膜外區(qū)域。用 SMART軟件對LjFNS蛋白的功能域進行分析， 結果顯示， 該蛋白含有亞鐵血紅素配合基結合位點，這是細胞色素P450家族的保守性區(qū)域，推測LjFNS蛋白屬于細胞色素P450家族。

表1 LjFNS蛋白的氨基酸組成

2.3 LjFNS基因的組織特異性表達

分別提取金銀花幼葉、老葉、幼莖、綠蕾、白花和黃花的總RNA，用實時熒光定量PCR方法分析LjFNS基因在金銀花的莖、葉和花等不同組織以及幼葉、白花與黃花等不同發(fā)育時期的表達特性。由圖3可以看出，該基因在各個組織中均有表達，但在白花中的表達量最高，其次為綠蕾與幼葉中的表達量，在白花與黃花之間的表達量差異達到了顯著水平(P<0.05)。在幼莖中LjFNS基因表達量最低，黃花中LjFNS基因表達量明顯高于幼莖中的表達量，差異達到了顯著水平(P<0.05)。由結果可知，LjFNS在金銀花中的表達表現出組織表達特異性與時間表達特異性，該基因的表達可能與花的發(fā)育緊密相關。

3 討論

植物細胞色素 P450 是最大的酶家族之一[6]， 它們在植物的生長發(fā)育與次生代謝過程中起著十分重要的作用，近年來，隨著對植物次生代謝機制研究的不斷深入，越來越多的P450蛋白陸續(xù)被發(fā)現，植物P450蛋白在植物次生代謝產物的合成、逆境生理的調控中的作用越來越被重視[7-9]。但至目前為止，有關植物細胞色素P450蛋白方面的研究仍主要集中于相關基因的克隆及基因功能預測等方面，在P450功能鑒定與轉基因方面的研究還相對較少，從已有的有關P450在植物次生代謝產物合成中的功能研究結果看出，植物P450主要參與生物堿、萜類、黃酮、脂肪酸等代謝產物的合成[10]，近年來有關植物P450參與的植物體內代謝催化機制方面的研究也越來越多[11]。

細胞色素P450是一類含血紅素結合亞基的多功能氧化酶[12]，是分子量約為55 ku(40～60 ku)的血紅素-硫鐵蛋白，有1個特征性的血紅素結合區(qū)域，主要為其C末端存在FxxGxRxCxG序列(其中x表示任意氨基酸)[6]，通常依據此序列來判定未知蛋白是否屬于P450家族。P450在生物體內主要以可溶性和與膜結合2種形態(tài)存在[13]，從目前已經鑒定的植物P450蛋白來看，以內質網結合型蛋白為主，內質網結合型蛋白在氨基端有1個特征性的疏水性螺旋，該螺旋以亮氨酸為主，該螺旋將蛋白定位于內質網膜上[6]。黃酮合成酶屬于植物細胞色素P450單加氧酶家族，它可以通過催化使圣草素轉變?yōu)槟鞠菟?，在金銀花主要活性成分的合成中起著十分重要的作用[14]。

本研究采用改進的染色體步移方法，首次從金銀花中克隆得到LjFNS的基因組和CDS序列，序列同源性分析表明，金銀花LjFNS基因編碼的CDS序列與擬南芥LOC9307309基因CDS序列相似度達89%。有研究表明，擬南芥LOC9307309屬于細胞色素P450家族，它在調節(jié)植物器官發(fā)育方面起著非常重要的作用[15-16]；還有研究表明，P450表達量的高低與黃酮類成分含量緊密相關[17]，推測LjFNS基因的表達可能參與調控金銀花黃酮類成分的合成。在本研究中采用qPCR的方法對LjFNS在金銀花中的組織表達特異性與時間特異性的分析結果顯示，LjFNS在白花中的表達量最高，該基因的表達可能與花的發(fā)育緊密相關。本研究從金銀花中發(fā)現了1個新的細胞色素P450家族成員并進行了相關功能預測的表達特性分析，為進一步開展LjFNS在金銀花的發(fā)育與有效成分合成過程中的功能研究奠定了基礎。

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