趙志常， 高愛平， 黃建峰， 羅睿雄， 劉寬亮

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，海南儋州 571737；2.國家熱帶果樹品種改良中心，海南儋州 571737； 3.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南?？?570228)

無色花青素還原酶(leucoanthocyantin reductase，簡稱LAR)催化黃烷3，4二醇轉(zhuǎn)化為2，3-反式黃烷三醇，比如生成兒茶素、沒食子兒茶素等[1-2]。目前已從擬南芥、茶樹、苜蓿、甘肅紅豆草、黑枸杞、百脈根等多種植物中克隆得到LAR基因[3-9]。LAR是由花青素還原酶(anthocyanidin reductase，簡稱ANR)經(jīng)過MYB轉(zhuǎn)錄因子家族共同調(diào)控的，對其酶活性的檢測也有相關(guān)的報道，如在蒺藜苜蓿中編碼LAR的基因已經(jīng)鑒定，并進(jìn)行了重組LAR經(jīng)體外純化后的活性檢測，而與金錢草的葉子純化過的酶活相比非常低；也有研究表明，不能檢測到蓮屬植物中重組LAR的任何活性，除非體系中只有單一蛋白且用無色花青素作底物時，可以檢測到LAR的微弱活性[2]。芒果(Mangiferaindica)是重要的熱帶、亞熱帶果樹，其果實(shí)色彩多樣，如綠色、黃色、淺黃色、紅色、橙紅色等[10]。芒果果實(shí)中含有黃酮類、類胡蘿卜素和花青素等物質(zhì)。芒果果實(shí)的LAR基因的研究工作未見報道，本研究采用RACE方法從芒果的果實(shí)中克隆得到1個LAR基因，深入探討該基因在芒果果實(shí)原花色素合成的作用機(jī)制及其對果實(shí)果皮的影響，借以深入揭示該基因在芒果果實(shí)作用的分子機(jī)制，為芒果果實(shí)生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在貴妃芒果完全成熟變黃時，用刀片取其果皮，切碎放入采樣袋中用液氮速凍后立即放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果皮總RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒，用DNase試劑盒進(jìn)行基因組DNA消除，RNase-free無菌水溶解，采用SMARTerTMRACE Amplification Kit(Clontech)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸7 min。反應(yīng)體系為25 μL，其中含10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 UTaqDNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。

1.3 LAR基因全長cDNA序列的獲得

以合成的cDNA為模板，根據(jù)已知的LAR基因片段設(shè)計cDNA 3′ RACE和5′RACE引物，進(jìn)行3′和5′端的擴(kuò)增。將目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序，并根據(jù)得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列結(jié)果拼接LAR的全長cDNA，設(shè)計特異引物，進(jìn)行全長cDNA序列的擴(kuò)增。

1.4 LAR基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)登錄的LAR蛋白序列進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹推斷其在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系。采用Bioedit軟件對LAR蛋白中各個氨基酸的含量、親水/疏水性進(jìn)行分析。采用WoLFPSORT(http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件進(jìn)行定位預(yù)測，采用Swissmodel(http：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.5 表達(dá)分析

分別提取3種不同色澤芒果的RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA并采用primer 5.0設(shè)計引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，簡稱RT-PCR)的擴(kuò)增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列為actin-F 5′-AATGGAACTGGAAT GGTCAAGGC-3′，actin-R 5′-TGCCAGATCTTCTCCATG TCATCCCA-3′；目的基因擴(kuò)增采用的引物為：LAR-F，5′-TCG GTCATTTTGTAGCCGAC-3′，LAR-R 5′-ATACAATG GAGCAACGTAACTA T-3′，PCR 產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并采用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，作出相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAR基因的獲得

根據(jù)得到的3′端和5′端序列信息進(jìn)行拼接，最后得到LAR基因的全長cDNA序列。根據(jù)拼接序列設(shè)計特異性引物進(jìn)行全長cDNA序列的擴(kuò)增，電泳條帶回收測序后得到LAR基因的cDNA全長序列為1 221 bp，分析發(fā)現(xiàn)開放閱讀框?yàn)?1 059 bp，編碼352個氨基酸序列，通過NCBI上已經(jīng)登錄的茶樹、草莓、大豆的LAR蛋白序列進(jìn)行了比對(圖1)發(fā)現(xiàn)，克隆的基因?yàn)槊⒐鸏AR基因。

2.2 芒果LAR基因的部分生物信息學(xué)分析

采用Bioedit軟件對芒果LAR蛋白中各個氨基酸的含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白天冬酰胺的含量較高，而其他的氨基酸含量相對比較低(圖2)，對其蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，芒果LAR蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，也具有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖3)。采用Bioedit軟件的Kyte和Doolittle算法對LAR蛋白的親水/疏水性(正值表示疏水性，負(fù)值表示親水性)進(jìn)行分析，LAR蛋白所含的氨基酸主要介于1.8～-2.4之間(圖4)。采用WoLFPSORT(http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件對LAR蛋白進(jìn)行定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該基因定位在細(xì)胞質(zhì)中，采用Swissmodel(http：//swissmodel.expasy.org/)在線軟件對蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，推導(dǎo)出該蛋白可能的三級結(jié)構(gòu)構(gòu)型(圖5)。采用DNAMAN軟件進(jìn)行親緣關(guān)系聚類分析發(fā)現(xiàn)，芒果LAR蛋白與棉花、葡萄、藍(lán)莓、柿等植物的蛋白序列聚為一類(圖6)。

2.3 LAR基因的RT-PCR分析

提取3種不同顏色的芒果品種果皮的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過上述RT-PCR分析的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因在綠色桂七品種的果實(shí)中表達(dá)較多，在紅色果皮的貴妃品種中表達(dá)次之，而黃色果皮的金煌品種中相對表達(dá)較少(圖7)。

3 討論

在果樹的果實(shí)中其次生代謝物合成與積累量取決于其合成途徑中一些關(guān)鍵酶的功能和含量，這些關(guān)鍵酶一般位于代謝支路分叉口或途徑的下游。芒果無色花青素還原酶(LAR)基因的克隆與分析有助于解析芒果果皮中兒茶素合成和積累的機(jī)制。聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芒果LAR蛋白與棉花、葡萄、藍(lán)莓、柿等可以聚為一類，說明在這些植物中LAR蛋白具有一定的相近關(guān)系，而生長在溫帶的蘋果、西洋梨、甜櫻桃、海棠、草莓等植物聚在一類，可見，LAR蛋白序列在不種植物間的差異符合一些植物學(xué)分類學(xué)的特征，在一定程度上反映不同果樹植物在進(jìn)化過程中對溫度的需求關(guān)系。對LAR基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在綠色果實(shí)品種中表達(dá)量較高，而在黃色品種中表達(dá)量較低，這可能與果實(shí)中原花色素、黃酮類物質(zhì)的含量有一定的關(guān)系。有研究報道，在紅豆草中LAR基因的表達(dá)在不同組織中有一定的差異，其中在葉片中的表達(dá)量最高，其次是花和果實(shí)，在莖稈中表達(dá)量最低[6]；在毛白楊中的表達(dá)[11]與此一致。Bogs等對LAR基因在葡萄中的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在葉子、花、果實(shí)中均有表達(dá)，且隨著葉子、花、果實(shí)的生長，原花色素不斷增加，在成熟的果實(shí)中表達(dá)LAR基因表達(dá)量較少，原花色素也不再增加[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，LAR基因在綠色桂七芒果品種中表達(dá)較高，而在黃色的金煌品種中表達(dá)量較低，這與果皮中原花色素的含量表現(xiàn)得一致。故推測，LAR基因表達(dá)在原花青素途徑中具有重要的作用。芒果LAR基因是芒果原花色素合成代謝途徑中的一個關(guān)鍵基因，其對芒果果皮色澤的影響具有重要作用，而其對芒果果實(shí)色澤功能的影響須要進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tanner G J，F(xiàn)rancki K T，Abrahams S，et al. Proanthocyanidin biosynthesis in plants. Purification of legume leucoanthocyanidin reductase and molecular cloning of its cDNA[J]. Journal of Biological Chemistry，2003，278(34)：31647-31656.

[2]Stafford H A，Lester H H. Enzymic and nonenzymic reduction of (+)-dihydroquercetin to its 3，4，-diol[J]. Plant Physiology，1982，70(3)：695-698.

[3]Stafford H A，Lester H H. Flavan-3-ol biosynthesis：the conversion of (+)-dihydromyricetin to its flavan-3，4-diol (Leucodelphinidin) and to (+)-gallocatechin by reductases extracted from tissue cultures of ginkgo biloba andPseudotsugamenziesii[J]. Plant Physiology，1985，78(4)：791.

[4]Bogs J，Jaffé F W，Takos A M，et al. The grapevine transcription factor VvMYBPA1 regulates proanthocyanidin synthesis during fruit development[J]. Plant Physiology，2007，143(3)：1347-1361.

[5]馬春雷，喬小燕，陳 亮. 茶樹無色花色素還原酶基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 茶葉科學(xué)，2013，30(1)：27-36.

[6]陳春燕，馬暉玲，董文科. 甘肅紅豆草無色花青素還原酶LAR基因的克隆和表達(dá)分析[J]. 草業(yè)學(xué)報，2015，24(6)：177-187.

[7]Paolocci F，Robbins M P，Madeo L，et al. Ectopic expression of a basic helix-loop-helix gene transactivates parallel pathways of proanthocyanidin biosynthesis. structure，expression analysis，and genetic control of leucoanthocyanidin 4-reductase and anthocyanidin reductase genes inLotuscomiculatus[J]. Plant Physiology，2007，143(1)：504-516.

[8]Pang Y Z，Peel G J，Wright E，et al. Early steps in proanthocyanidin biosynthesis in the model legumeMedicagotruncatula[J]. Plant Physiology，2007，145(3)：601-615.

[9]Shen X F，Zeng S H，Wu M，et al. Characterization of proanthocyanin-related leucoanthocyanidin reductase and anthocyanidin reductase genes inLyciumruthenicumMurr[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2014，23(6)：369-377.

[10]Litz R E. The mango：botany，production and uses[M]. UK：CABI Head Office，2005.

[11]Wang Y P，Yang Z M，Zhang B. Identification of protein related to biosynthesis of condensed tannin inOnobrychistanaiticaSpreng[J]. Acata Agrestia Sinica，2000，8(2)：126-131.

[12]Bogs J，Downey M O，Harvey J S，et al. Proanthocyanidin synthesis and expression of genes encoding lecoanthocyanidin reductase in developing grape berries and grapevine leaves[J]. Plant Physiology，2005，139(2)：652-663.