◎ 林曉華

（安徽糧食工程職業(yè)學(xué)院，安徽 合肥 230013）

α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶主要是由黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵生產(chǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)開發(fā)研究領(lǐng)域，主要包括生產(chǎn)低聚異麥芽糖[1-5]、淀粉水解[6]、酒精發(fā)酵、代謝機(jī)理研究、食品成分分析和醫(yī)學(xué)診斷[7-8]等方面。但目前國內(nèi)生產(chǎn)α-葡萄轉(zhuǎn)糖苷酶酶制劑廠家較少，其發(fā)酵周期較長(zhǎng)，所耗的培養(yǎng)基量較多，酶的產(chǎn)量和特性不易控制，因此對(duì)于α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶生產(chǎn)成本的控制是各酶制劑廠家急需解決的問題。啤酒廢酵母是啤酒工業(yè)的主要副產(chǎn)物之一。生產(chǎn)100 t啤酒可產(chǎn)1～1.5 t的啤酒廢酵母（以干重計(jì)），啤酒廢酵母若直接排棄，必將產(chǎn)生環(huán)境污染，同時(shí)給企業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。因此，利用啤酒廢酵母開發(fā)高附加值產(chǎn)品已經(jīng)被啤酒同行所關(guān)注。

鑒于此，本文以啤酒酵母自溶物替代微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母浸膏，研究其對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，為啤酒廢酵母的綜合利用提供更為直接和廉價(jià)的方法打下良好的理論基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶發(fā)酵工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）菌種、乙酸、乙酸鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸二氫鈉、鹽酸、4-氨基安替比林、苯酚、α-甲基葡萄糖。

1.2 儀器與設(shè)備

天平、可見分光光度計(jì)、滅菌鍋、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)等。

1.3 方法

（1）培養(yǎng)基。①菌種斜面培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基。②種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40～50 g/L、酵母膏18 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、尿素2 g/L，pH 5.5～6.0，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，改變培養(yǎng)基的各組分。③酵母自溶物的制備：取啤酒廢酵母按質(zhì)量比1∶1加水稀釋后，添加3% NaCl，調(diào)pH至6.5，50 ℃條件下自溶48 h，取出后至沸水浴中滅酶10 min，冰箱冷藏保存待用。

（2）接種及培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基接種后至于30 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3 d，取10 mL無菌水用接種環(huán)刮取斜面菌落搖勻后取2.5 mL接種至裝有25 mL培養(yǎng)基的小搖瓶（250 mL）作為一級(jí)種子，200 r/min，30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h后，按10%接種量接種到發(fā)酵搖瓶，在溫度為30 ℃，發(fā)酵初始 pH 5.5～6.0，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下發(fā)酵110～120 h取樣測(cè)定。

（3）酶活檢測(cè)[11]。參考QB 2525-2001《食品添加劑α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶》的方法進(jìn)行酶活的測(cè)定。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以啤酒酵母自溶物代替酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定酵母自溶物的最適添加量。并在此基礎(chǔ)上對(duì)黑曲霉培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化。通過Design-Expert 7.1（Stat-Ease,Inc.）對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母自溶物添加量對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基按葡萄糖40～50 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，尿素2 g/L，酵母自溶物作為氮源分別添加80、100、120、140 mL/L和160 mL/L，pH 5.5～6.0，滅菌后接種黑曲霉菌種子培養(yǎng)基，200 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)120 h后，取發(fā)酵上清液測(cè)定α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶活力。同時(shí)作對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酵母自溶物的添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響圖

由試驗(yàn)可知，在酵母自溶物添加量為120 mL/L時(shí)，α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶可以達(dá)到最大值175 U/mL，而添加酵母膏的對(duì)照組在相同培養(yǎng)條件下發(fā)酵所得酶活力為165 U/mL，由此可知，以啤酒酵母自溶物代替酵母膏作為N源是可行的，經(jīng)過與原培養(yǎng)基成本對(duì)比，可以減少5%的培養(yǎng)基成本。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的單因素試驗(yàn)

以α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶為指標(biāo)，分別研究了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵初始pH和攪拌速度對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵初始pH、攪拌速度和發(fā)酵溫度進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)，每組2個(gè)重復(fù)。正交設(shè)計(jì)表格見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

發(fā)酵條件對(duì)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶產(chǎn)量的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素影響α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶產(chǎn)量的順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即發(fā)酵初始pH是影響α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶活力的主要因素，其次是發(fā)酵時(shí)間，然后是發(fā)酵溫度、攪拌速度，最適發(fā)酵條件為A2B2C2D1，即在發(fā)酵初始pH為6.5，發(fā)酵溫度30 ℃，攪拌速度為200 r/min，發(fā)酵120 h所得的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶活力最高。通過對(duì)最佳發(fā)酵條件的組合進(jìn)行5次驗(yàn)證性試驗(yàn)，測(cè)得α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶活力的平均值可以達(dá)到200 U/mL。

表2 α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶產(chǎn)量的正交試驗(yàn)結(jié)果表

3 結(jié)論

文章通過對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，選用了自制的啤酒酵母自溶物替代了商業(yè)酵母膏作為氮源，在此基礎(chǔ)上對(duì)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間，攪拌速度和初始pH等發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出了最佳的發(fā)酵工藝，降低了α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的培養(yǎng)基成本，提高了產(chǎn)量。

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