陳軍 吳少澤 周盈盈 張素勤 季亢挺

心肌細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間的缺血狀態(tài)可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的心肌壞死[1]，長(zhǎng)時(shí)間的缺血后發(fā)生的再灌注不但對(duì)缺血心肌無(wú)改善作用，反而可引起心肌超微結(jié)構(gòu)破壞，代謝和電生理的損傷，稱(chēng)之為缺血再灌注損傷[2]。心肌梗死是一種致命性的疾病，目前臨床上主要的治療措施是進(jìn)行冠狀動(dòng)脈介入治療，短時(shí)間內(nèi)再次開(kāi)通堵塞的血管，能夠有效地減少梗死心肌的損傷，降低患者的病死率[3]。但是，長(zhǎng)時(shí)間缺血后的介入治療，血流再通后缺血部位的心肌必然會(huì)遭受缺血再灌注的二次損傷[4]。目前，大量的研究證實(shí)，氧化應(yīng)激在缺血再灌注中具有重要的意義，因此抗氧化應(yīng)激治療可以減少心肌缺血再灌注損傷[5]。普魯士藍(lán)納米顆粒（Prussian blue nanoparticles，PBNPs）是一種具有抗氧化能力的化學(xué)合成產(chǎn)物[6]。有研究表明PBNPs可以保護(hù)細(xì)胞免受紫外、二烯丙基三硫（diallyltrisulfide，DATS）、脂多糖、佛波酯、高糖等培養(yǎng)環(huán)境引起的自由基損傷，并且可以保護(hù)神經(jīng)海馬細(xì)胞在復(fù)氧（指糖分和氧氣剝奪的復(fù)氧過(guò)程）過(guò)程中的損傷，提示PBNPs是一種潛在的缺血再灌注損傷保護(hù)劑[7]。本研究通過(guò)PBNPs預(yù)處理，觀察其在小鼠心肌缺血再灌注中的作用，并探討潛在的機(jī)制，為缺血再灌注的治療提供新的思路。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí) C57BL/6 小鼠（雄性，20～25g）24 只，購(gòu)自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房（飲用純凈水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲食。生活節(jié)律為晝夜12h，恒溫恒濕）。H9c2心肌細(xì)胞，購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)基每2d更新一次。

1.2 藥物和試劑 PBNPs（南京東納生物科技有限公司），Evans Blue染料、TTC染料（美國(guó)Sigma公司），高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)GBICO公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所），叔丁基過(guò)氧化氫（TBHP，中國(guó)阿拉丁公司），SOD一抗、Bcl-2一抗、Bax一抗、GAPDH（美國(guó)Abcam公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分成4組，每組6只。假手術(shù)組（Sham組）：小鼠尾靜脈射0.2ml0.9%氯化鈉溶液，30min后異氟醚麻醉小鼠，開(kāi)胸暴露心臟，用7-0的無(wú)菌絲線從左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）下通過(guò)，不結(jié)扎；模型組（I/R組）：小鼠尾靜脈射0.2ml 0.9%氯化鈉溶液，30min后異氟醚麻醉小鼠，開(kāi)胸暴露心臟，用7-0的無(wú)菌絲線結(jié)扎LAD，30min后松開(kāi)結(jié)扎線，再灌注4h，取血、取心臟；低劑量組（I/R+L組）：用200μg/kgPBNPs小鼠尾靜脈注射，預(yù)處理30min，異氟醚麻醉小鼠，再用7-0的無(wú)菌絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30min，再灌注 4h，取血、取心臟；高劑量組（I/R+H組）：用1000μg/kgPBNPs小鼠尾靜脈注射，預(yù)處理30min，異氟醚麻醉，再用7-0的無(wú)菌絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30min，再灌注4h，取血、取心臟[8]。

1.4 心肌梗死面積測(cè)定[9]按照上述分組，小鼠心肌缺血再灌注4h后，重新開(kāi)胸，用2%Evans blue染液從下腔靜脈注射到體內(nèi)，待心臟及小鼠皮膚完全呈現(xiàn)藍(lán)色后，快速取出心臟，用PPS稍沖洗多余染液，將心臟放入切片模具中，用（OCT）包埋，-20℃冰凍20min。垂直心臟長(zhǎng)軸切片，1mm/section，切5片，放入1%TTC染液中，37℃孵育15min。心肌未缺血的區(qū)域呈現(xiàn)藍(lán)顏色，缺血但尚具有細(xì)胞活性的區(qū)域被染成紅色，稱(chēng)為危險(xiǎn)區(qū)（area at risk，AAR），缺血且梗死的區(qū)域呈現(xiàn)白色，稱(chēng)為梗死區(qū)（infract area，INF）。心肌梗死面積使用Image Pro Plus軟件計(jì)算，最終結(jié)果以INF/AAR表示和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 細(xì)胞生存率檢測(cè) 為了研究PBNPs對(duì)H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用，我們用叔丁基過(guò)氧化氫（TBHP）刺激H9c2細(xì)胞來(lái)模擬缺血再灌注的氧化應(yīng)激損傷。H9c2細(xì)胞鋪于96孔板，每孔8 000個(gè)細(xì)胞，四周邊孔不鋪，放恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后進(jìn)行加樣檢測(cè)。用不同濃度的叔丁基過(guò)氧化氫刺激H9c2細(xì)胞以及不同濃度的PBNPs預(yù)干預(yù)細(xì)胞，培養(yǎng)12h。每孔加入MTT試劑10μl，恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后用酶標(biāo)儀570nm測(cè)定吸光度。最終結(jié)果以空白對(duì)照組（加入等量的培養(yǎng)基）生存率為100%進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.6 生化指標(biāo)檢測(cè) 按照上述分組，心肌再灌注4h結(jié)束時(shí)，取小鼠血清，分別測(cè)定血清MDA、SOD等生化指標(biāo)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 心肌組織中SOD和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的濃度檢測(cè) 按照上述分組方法，心肌再灌注4h后，取心肌組織，用免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)各組心肌組織中SOD和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,其中兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌梗死面積比較 見(jiàn)圖1（封三）。

由圖1可見(jiàn)，與I/R組比較，I/R+H組的梗死面積[（20.37±3.77）%vs（48.51±3.56）%]明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組心肌細(xì)胞生存率比較 見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，與空白對(duì)照組相比，用100μM和200μM的TBHP刺激細(xì)胞能夠使細(xì)胞存活率顯著降低（均P＜0.05）。在隨后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度的PBNPs預(yù)處理H9c2細(xì)胞，然后再用100μM的TBHP濃度來(lái)誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷，最后用MTT試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的生存率，300μg/mlPBNPs預(yù)處理組能夠顯著增加細(xì)胞的生存率，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組心肌細(xì)胞生存率比較[A：不同濃度的TBHP對(duì)H9c2細(xì)胞活力的影響：在100μM（0.56±0.04）和200μM（0.49±0.03）TBHP組中細(xì)胞生存率被顯著抑制（與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05）；B：PBNPs預(yù)處理對(duì)TBHP刺激的H9c2細(xì)胞生存率的影響：300μg/mlPBNPs預(yù)處理組（0.97±0.04）顯著增加細(xì)胞生存率（與TBHP組比較，#P＜0.05）]

2.3 各組SOD活性和MDA水平比較 見(jiàn)圖3。

圖3 各組SOD活性和MDA水平比較[A：SOD活性統(tǒng)計(jì)圖；B：MDA水平統(tǒng)計(jì)圖。與Sham組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05]

由圖3可見(jiàn)，I/R組的SOD濃度[（121.2±10.32）nmol/mg]較Sham組[（201±10.1）nmol/mg]顯著降低，而I/R+H組較I/R組能夠顯著增加SOD[（183±11.37）nmol/mg]活性，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。同時(shí)，I/R組的MDA濃度[（4.32±0.35）nmol/mg]較Sham組[（1.5±0.11）nmol/mg]顯著升高，而I/R+H組較I/R組能夠顯著降低MDA[（1.84±0.24）nmol/mg]水平，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 各組抗氧化蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，I/R組與Sham組相比，顯著增強(qiáng)了凋亡蛋白 Bax（0.73±0.03VS.0.49±0.01，P＜0.01）的表達(dá)，減少了 SOD（0.47±0.02VS.0.69±0.02，P＜0.01）和抗凋亡蛋白 Bcl-2（0.32±0.02VS.0.54±0.04，P＜0.01）的表達(dá)，而I/R+H組較I/R組相比，PBNPs預(yù)處理顯著抑制了凋亡蛋白Bax（0.54±0.01）的表達(dá)，且增強(qiáng)了 SOD（0.67±0.03）和 Bcl-2（0.53±0.04）的表達(dá)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）。

3 討論

在本研究中，我們成功構(gòu)建了小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，且發(fā)現(xiàn)PBNPs預(yù)處理能夠顯著減少缺血再灌注后小鼠的心肌梗死面積，增加體外心肌細(xì)胞存活率，增加缺血再灌注小鼠血清中SOD活性并降低MDA水平，并可以抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，綜上表明PBNPs可通過(guò)減少氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心肌缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。

圖4 各組抗氧化蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較[A：各組心肌組織抗氧化蛋白SOD及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2免疫印跡結(jié)果條帶圖；B-D：各組心肌組織抗氧化蛋白SOD及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖，與Sham組比，**P＜0.01，與I/R組比，##P＜0.01]

心肌缺血再灌注損傷是指心肌局部缺血后恢復(fù)血流后所產(chǎn)生的不可避免的損傷[10]。這是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)境中的許多機(jī)制，其中一部分由活性氧（ROS）介導(dǎo)。細(xì)胞內(nèi)的ROS主要來(lái)源于線粒體的氧化呼吸鏈，當(dāng)ROS的產(chǎn)生和清除之間的平衡受到破壞時(shí)，可能發(fā)生對(duì)細(xì)胞的不可逆損傷，最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[11]。SOD是一種生物酶，他可以通過(guò)岐化方式清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基O2-，保護(hù)細(xì)胞和基質(zhì)免受氧自由基的損害。其活力的高低反應(yīng)體內(nèi)自由基的變化情況。胞外SOD活性的降低，能顯著增加氧化應(yīng)激[12]。而MDA作為氧自由基,它與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化物的程度，間接反應(yīng)了細(xì)胞受自由基的損傷程度[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，缺血再灌注損傷組（I/R組）較對(duì)照組（Sham組）的小鼠血清中SOD活性明顯降低，而MDA釋放水平明顯升高，進(jìn)一步提示氧化應(yīng)激的過(guò)度激活與小鼠心肌的缺血再灌注損傷密切相關(guān)。因此，使用抗氧化劑來(lái)治療心肌缺血再灌注損傷已經(jīng)成為了一個(gè)新的治療策略[14]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡可能是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的另一重要環(huán)節(jié)[15]。早在1994年，Gottlieb等首先在兔心臟上發(fā)現(xiàn)再灌注損傷促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[16]。此后姚震等研究表明，不同時(shí)間的心肌缺血再灌注損傷均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，以缺血30～60min后再灌注時(shí)明顯[17]。Bcl-2和Bax是心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控蛋白，它們同屬于Bcl-2家族，前者主要起抗凋亡作用，后者則起到促凋亡作用[18]。本研究中缺血再灌注損傷組（I/R組）較對(duì)照組（Sham組）抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步為缺血再灌注損傷引起心肌細(xì)胞凋亡提供了理論依據(jù)，而如何減少細(xì)胞凋亡對(duì)防治缺血再灌注損傷的具有重要意義。

普魯士藍(lán)最早是1706年在德國(guó)合成，當(dāng)時(shí)是一種廣泛應(yīng)用的染料。后來(lái)，普魯士藍(lán)逐漸被應(yīng)用于磁學(xué)、光學(xué)、電化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[19-21]。直至2003年，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)普魯士藍(lán)作為鉈中毒的解毒劑。近年來(lái)，Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，PBNPs可以模擬三種抗氧化酶的能力：過(guò)氧化物酶（POD），過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），且對(duì)羥基自由基（·OH）有很強(qiáng)的親和力，而PBNPs的這些能力在許多形式的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡過(guò)程中，可以作為強(qiáng)有力的ROS清除劑，從而減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和凋亡[22]。目前尚無(wú)關(guān)于PBNPs在心肌缺血再灌注損傷中作用的研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建體外及在體小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)PBNPs預(yù)處理可以通過(guò)提高心肌細(xì)胞氧自由基的清除能力，抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力以及減少心肌細(xì)胞凋亡，從而對(duì)心肌缺血再灌注損傷提供保護(hù)作用。本研究首次闡明了PBNPs對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討了其機(jī)制可能是通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抗心肌細(xì)胞凋亡，為預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷提供了重要的理論依據(jù)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

然而在我們的研究中仍存在一些限制。首先，在本實(shí)驗(yàn)中我們使用的H9c2細(xì)胞是源自胚胎BD1X大鼠的心臟組織的大鼠心肌細(xì)胞，其具有更多的骨骼肌細(xì)胞的特征，因此，如果用成年鼠原代心肌細(xì)胞可能能夠更好研究PBNPs的潛在作用。第二，我們使用叔丁基過(guò)氧化氫刺激H9c2細(xì)胞來(lái)模仿細(xì)胞缺氧和再氧合損傷時(shí)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激狀態(tài)，這有點(diǎn)不同于實(shí)際心肌缺血再灌注。第三，在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用PBNPs預(yù)防性給藥來(lái)治療局部缺血，而這種預(yù)處理方式在某種程度上不太符合臨床，大多數(shù)患者到醫(yī)院已發(fā)生心肌梗死，因此后續(xù)我們將嘗試研究PBNPs在心肌梗死中給藥的療效。

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