錢 驊，錢康英，陳 斌，黃曉德，朱羽堯，趙伯濤*

( 1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；2.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023 )

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是一種地理分布范圍廣、寄主廣泛、極具破壞力的植物根系專性內(nèi)寄生線蟲。我國(guó)危害最嚴(yán)重，分布最廣的主要有如下四種線蟲：花生根結(jié)線蟲(M.arenaria), 北方根結(jié)線蟲(M.hapla), 南方根結(jié)線蟲(M.incognita), 和爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)。為了有效控制根結(jié)線蟲的發(fā)生與為害，人們對(duì)該類線蟲的生物學(xué)特性、致病性以及各種防治方法等進(jìn)行廣泛深入地研究，而根結(jié)線蟲培養(yǎng)和保存的研究相對(duì)較少。寄主的抗根結(jié)線蟲活性鑒定、體外抗根結(jié)線蟲活性試驗(yàn)的物質(zhì)篩選等，均需要大量生育階段一致的線蟲。從自然染病土壤或染病植物根中分離線蟲蟲齡不一致。一直以來(lái)，根結(jié)線蟲的繁殖和保存多利用活體寄主植物，如盆栽番茄[1-2]、馬鈴薯[3]、空心菜[4]培養(yǎng)根結(jié)線蟲等。鮑時(shí)翔[5]、劉麗[6]分別利用香蕉枯萎病鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.spcubense) 和牡丹根腐病鐮刀菌(Fusariumsolani)培養(yǎng)和繁殖根結(jié)線蟲的方法，解決了根結(jié)線蟲的培養(yǎng)依賴寄主植物的問(wèn)題，使得根結(jié)線蟲的全部生命周期能在培養(yǎng)皿中完成，但仍然存在供試菌種單一，操作過(guò)程繁瑣等缺陷。為了擴(kuò)大供試菌種和進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作過(guò)程，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上探索發(fā)現(xiàn)，灰霉菌(Botrytiscinerea)制作的二重培養(yǎng)基接種栝樓和番茄根結(jié)線蟲，在較短培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)可培養(yǎng)出大量根結(jié)線蟲，具有操作更簡(jiǎn)便，可高效繁殖和長(zhǎng)期保存根結(jié)線蟲的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

根結(jié)線蟲侵染的番茄根部由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所提供，根結(jié)線蟲侵染的栝樓根部采自安徽省潛山縣梅城鎮(zhèn)的栝樓種植地。灰霉菌(Botrytiscinerea)為南京師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種。腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)ZZG-1菌珠，中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心。

1.2 方法

1.2.1 根結(jié)線蟲分離

(1) 貝爾曼漏斗法

參考鐘雪超[7]法,將病根用清水洗凈，用1%的NaClO浸泡消毒3 min，再用無(wú)菌水漂洗3遍；將根部用解剖刀切成約1 cm的小段，置于漏斗中，加無(wú)菌水漫過(guò)根部組織塊，線蟲遇水從植物組織內(nèi)游出，同時(shí)在地心引力及線蟲自身的重量的作用下，下沉至漏斗下方連接的小管中，收集小管中的根結(jié)線蟲。這種方法僅能分離活動(dòng)性的蠕蟲型線蟲，即分離得到的是幼蟲或雄性成蟲，而卵和雌性成蟲無(wú)法通過(guò)此方法獲得。

(2)直接挑取卵囊與雌性成蟲

將病根用清水洗凈，用1%的NaClO浸泡消毒3 min，再用無(wú)菌水漂洗3遍；取病根至培養(yǎng)皿中，左手持鑷子固定，右手持解剖刀將病根沿導(dǎo)管方向豎直切開。在解剖鏡下尋找根結(jié)線蟲的卵囊和雌性成蟲，并用解剖針挑出，置于3 cm培養(yǎng)皿內(nèi)。

1.2.2 二重培養(yǎng)基的制備

在新配制的培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫條件下活化菌種，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，挑取少量菌絲于PDA液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：150 r/min，28 ℃恒溫培養(yǎng)。4天后出現(xiàn)許多大小不一的菌絲球,挑取菌絲球，接種至固體PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)基厚度約3～5 mm，以延長(zhǎng)根結(jié)線蟲的培養(yǎng)時(shí)間，在室溫、室內(nèi)自然散射光下培養(yǎng)，一定的光照能夠促進(jìn)灰霉菌菌絲生長(zhǎng)[8]，4～5天后整個(gè)培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿菌絲，即為二重培養(yǎng)基。

1.2.3 根結(jié)線蟲體外培養(yǎng)

(1) 根結(jié)線蟲接種方法

收集1.2.1分離的到的根結(jié)線蟲，在10 mL離心管中用無(wú)菌水洗滌、離心(2 000 r/min ,1 min)3次，每次6 mL無(wú)菌水，收集線蟲。在顯微鏡下計(jì)數(shù)稀釋，得到密度為約50條/100 μL線蟲懸液。將線蟲懸液接種到已培養(yǎng)好的灰霉和腐皮鐮孢菌二重培養(yǎng)基上(直徑3 cm培養(yǎng)皿)，每個(gè)培養(yǎng)基上接種200 μL(約100條線蟲)，合蓋靜置30 min使液滴浸沉，然后放置在室內(nèi)陰涼處倒置培養(yǎng)。

(2) 淌水法從培養(yǎng)皿上收集根結(jié)線蟲

將二重培養(yǎng)基皿的一側(cè)稍微墊高，在墊高處滴少許無(wú)菌水，讓無(wú)菌水緩緩趟下，根結(jié)線蟲緩緩爬入水中，靜置5 min，便可得到大部分線蟲。待根結(jié)線蟲在二重培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)卵、孵化，得到生長(zhǎng)發(fā)育一致的二齡幼蟲。

(3) 傳代培養(yǎng)和保存

灰霉菌二重培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)有限，以及根結(jié)線蟲生長(zhǎng)繁殖一定時(shí)間后生長(zhǎng)、繁殖速度減緩，甚至停止生長(zhǎng)，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)時(shí)，可以用淌水法從原二重培養(yǎng)基上洗下線蟲，重新制備線蟲懸液，再接種到新的灰霉菌二重培養(yǎng)基上培養(yǎng)。或者用接種鏟取1 cm見(jiàn)方的帶有線蟲的二重培養(yǎng)基小塊，直接放到新的灰霉菌二重培養(yǎng)基上，進(jìn)行倒置培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

取新鮮的栝樓根結(jié)線蟲病根與健康根部，清洗，徒手切片制作標(biāo)本，在顯微鏡下觀察結(jié)果，見(jiàn)圖1。栝樓根健康根部(1A)具有完整的導(dǎo)管、形成層組織，栝樓根結(jié)線蟲病根(1B )的導(dǎo)管和形成層組織已破壞，組織細(xì)胞周圍布滿蟲卵卵囊。

圖2為分離得到的栝樓根結(jié)線蟲卵囊、根結(jié)線蟲雌性成蟲、根結(jié)線蟲蠕蟲形態(tài)在解剖鏡(20×)和顯微鏡(80×)下的觀察結(jié)果。2A 為根結(jié)線蟲卵囊，可見(jiàn)中間的黑點(diǎn)，即為根結(jié)線蟲卵粒。 2B 為梨形的根結(jié)線蟲的雌性成蟲；2C 為貝爾曼法分離得到的蠕蟲形態(tài)的根結(jié)線蟲，其中包括J2、J3、J4 時(shí)期的幼蟲與雄性成蟲。

2.2 栝樓根結(jié)線蟲培養(yǎng)平板的變化及分析

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下，28 ℃恒溫培養(yǎng)的灰霉菌生長(zhǎng)緩慢，10天后仍未鋪滿培養(yǎng)平板。而在自然散射光下，室內(nèi)溫度15～25 ℃培養(yǎng)4～5 d 即能長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)平板，即灰霉在黑暗和變溫條件下更有利于生長(zhǎng)，這與楊紅玉報(bào)道的在灰霉菌絲生長(zhǎng)階段給予一定的光照有利于菌絲生長(zhǎng)相同[8]。

接種栝樓根結(jié)線蟲后，定期觀察栝樓根結(jié)線蟲在二重培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)和二重培養(yǎng)基變化情況，見(jiàn)圖3。3A 為制備好的灰霉菌二重培養(yǎng)基，表面全部被白色菌絲覆蓋；3B 為接種根結(jié)線蟲懸液3 天后的灰霉菌二重培養(yǎng)基，液滴覆蓋部分的培養(yǎng)基表面灰霉菌白色菌絲消失；3C 為接種根結(jié)線蟲懸液10 天后的灰霉菌二重培養(yǎng)基，表面覆蓋的灰霉菌白色菌絲約2/3 已經(jīng)消失；3D 為轉(zhuǎn)接根結(jié)線蟲懸液15天后的灰霉菌二重培養(yǎng)基，二重培養(yǎng)基表面覆蓋的灰霉菌白色菌絲已完全消失。

圖1 栝樓病根切片

圖2 栝樓結(jié)線蟲的卵囊、根結(jié)線蟲雌性成蟲、蠕蟲形態(tài)

圖3 栝樓根結(jié)線在霉菌二重培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

結(jié)果表明：栝樓根結(jié)線蟲在灰霉二重培養(yǎng)基中可以灰霉菌菌絲為食物源，能夠在二重培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；但是栝樓根結(jié)線蟲接種在腐皮鐮孢菌二重培養(yǎng)基后，沒(méi)有菌絲的消失和新增根結(jié)幼蟲，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原接種的J2幼蟲也死亡。番茄根結(jié)線蟲也取得與栝樓相同的試驗(yàn)結(jié)果(未列圖)。

繼續(xù)觀察上述接種的栝樓根結(jié)線蟲在灰霉二重培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)繁殖情況，見(jiàn)圖4。圖4A為3周之后的二重培養(yǎng)基，上面白色的小點(diǎn)為卵囊，或是卵囊孵化出的二齡幼蟲聚集體；圖4B是將圖4A中用解剖針挑開白色小點(diǎn)后，在上面滴1滴無(wú)菌水，二齡幼蟲游出的圖示情況；圖4C為3～4周后，孵化出的幼蟲不斷離開原卵囊位置的圖示；圖4D 為4 周之后二重培養(yǎng)基，繁殖的根結(jié)線蟲密度很大，約2 000條/cm3。

圖4 栝樓根結(jié)線在培養(yǎng)基上的繁殖情況

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接種栝樓和番茄根結(jié)線蟲的灰霉二重培養(yǎng)基中，只有蠕蟲形態(tài)的根結(jié)線蟲，而沒(méi)有如寄主根結(jié)中分離到的梨形雌性成蟲，但在此二重培養(yǎng)基中觀察到有卵、卵囊和成團(tuán)的二齡幼蟲。據(jù)此猜測(cè)二重培養(yǎng)基中可能存在蠕蟲形態(tài)的雌性根結(jié)線蟲。

如需進(jìn)一步傳代培養(yǎng)根結(jié)線蟲，則灰霉二重培養(yǎng)基接種根結(jié)線蟲4 周后，此時(shí)平板內(nèi)線蟲密度達(dá)到最高時(shí)，收集J2期幼稚蟲，進(jìn)行傳代培養(yǎng)較好；如需長(zhǎng)時(shí)間保存根結(jié)線蟲，則在接種根結(jié)線蟲2～3周時(shí)，平板內(nèi)根結(jié)線蟲進(jìn)入繁殖高峰時(shí)，可將二重培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至冷涼條件(12 ℃)下保存。推測(cè)在培養(yǎng)基不干枯的前提下能夠保存5～6個(gè)月[5-6]。

3 小 結(jié)

(1)以感染根結(jié)線蟲的栝樓和番茄根為材料，用簡(jiǎn)化改良的貝爾曼漏斗法分離得到蠕蟲形態(tài)的線蟲。

(2)比較灰霉菌和腐皮鐮刀菌制作的二重培養(yǎng)基上栝樓和番茄根結(jié)線蟲的生長(zhǎng)和繁殖情況，得到只有灰霉菌可作為栝樓和番茄根結(jié)線蟲的食物，可

用來(lái)制備根結(jié)線蟲增殖的二重培養(yǎng)基。

(3)在灰霉菌二重培養(yǎng)基上接種根結(jié)線蟲懸液，并在室內(nèi)自然散射光下，15～25 ℃倒置培養(yǎng)3～4周，可獲得大量生長(zhǎng)一致的幼齡期(J2)根結(jié)線蟲，密度約2 000條/cm3。如要長(zhǎng)期保存根結(jié)線蟲，則在接種2～3周后將二重培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至冷涼條件(12 ℃)下保存。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王汝賢,王剛.根結(jié)線蟲的一種水培繁殖方法[J]. 植保技術(shù)與推廣,1999 , 19(5):8-9.

[2] 萬(wàn)景旺.根結(jié)線蟲生防菌的篩選與應(yīng)用研究[D]. 徐州：中國(guó)礦業(yè)大學(xué),2014.

[3] 吳慶麗,王鮮,廖金鈴,等. 不同光溫條件對(duì)馬鈴薯繁殖根結(jié)線蟲效果的影響[J]. 植物保護(hù), 2006(6):27-29.

[4] 焦春偉,徐春玲,謝輝,等.用沙培空心菜繁殖根結(jié)線蟲效果的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012,40(3):126-130.

[5] 鮑時(shí)翔，曾慶飛，方哲,等. 一種植物根結(jié)線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法：CN101473808A [P]. 2009-01-22.

[6] 劉麗,顏世翠,姚良同,等. 一種番茄根結(jié)線蟲人工培養(yǎng)和保存的優(yōu)化方法[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012,44( 11) : 117-120.

[7] 鐘雪超. 土壤線蟲的分離方法[J]. 環(huán)境, 2012 (S1): 147-149.

[8] 楊紅玉，李湘，張一凡，等. 灰霉菌培養(yǎng)及其對(duì)擬南芥的侵染[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2005(4): 431-434.