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多重PCR法在食品中致瀉大腸埃希氏菌質(zhì)控考核中的應(yīng)用

2018-06-05 01:32:05史曉娟,魏紅霞,賀?;?/span>
食品安全導(dǎo)刊 2018年14期
關(guān)鍵詞:埃希氏肉湯微生物學(xué)

1.引言

大腸埃希氏菌俗稱大腸桿菌,是人類和動(dòng)物的腸道中重要的正常菌群,為宿主提供一些有營(yíng)養(yǎng)作用的合成代謝產(chǎn)物。多數(shù)大腸埃希氏菌并不致病,當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時(shí),可作為條件致病菌而引起腸道外的感染,引起胃腸炎的大腸埃希氏菌分為五類即腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EⅠEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)和粘附性腸埃希氏菌(EAEC)[1]??焖贆z測(cè)和鑒定病原菌是及時(shí)有效地控制與預(yù)防傳染病傳播的重要手段。傳統(tǒng)的微生物學(xué)分離與鑒定以及血清學(xué)方法在鑒別與鑒定病原微生物方面日益顯現(xiàn)出不足。PCR法快速、敏感、特異,是對(duì)病原菌快速鑒別與分型的重要技術(shù)之一,而多重PCR更以其突出的優(yōu)越性得到了廣泛的應(yīng)用[2]。

2.材料與方法

2.1 樣品

樣品編號(hào)為15-1, 15-2,每份考核樣品包含西林瓶1個(gè),西林瓶中裝有白色凍干菌球。本次考核共計(jì)2份樣品。

2.2 試劑及儀器

營(yíng)養(yǎng)肉湯、腸道菌增菌肉湯、麥康凱瓊脂(MAC)、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、三糖鐵(TSⅠ)瓊脂、大腸埃希氏菌生化套盒、無(wú)菌雙蒸水,以上試劑均使用北京路橋。五種致瀉大腸埃希氏菌DNA提取試劑盒、多重PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒均使用北京卓誠(chéng)惠生,實(shí)時(shí)定量PCR儀器(BⅠO-RAD公司),凝膠成像儀(BⅠO-RAD公司),電泳儀。

2.3 試驗(yàn)方法

按照GB4789.6-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》[2]開(kāi)始檢測(cè)。

2.3.1 樣品前處理與預(yù)增菌

待質(zhì)控樣品恢復(fù)至室溫,無(wú)菌開(kāi)啟瓶蓋,將西林瓶中的白色菌球完全溶解于50mL無(wú)菌生理鹽水中,作為樣本。

2.3.2 以無(wú)菌操作量取檢樣25mL,加入裝有225mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的無(wú)菌袋中,振蕩混勻。將營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌液放置于36℃培養(yǎng)18h(增菌時(shí)間延長(zhǎng))。取1mL(加樣量增大),接種于30mL腸道菌增菌肉湯管內(nèi),于42℃培養(yǎng)18h。

2.3.3 分離

將增菌液劃線接種MAC和EMB瓊脂平板,于36℃培養(yǎng)24h,觀察菌落特征。

2.3.4 生化鑒定

選取平板上10個(gè)可疑菌落,分別接種TSⅠ斜面。同時(shí)將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、尿素瓊脂(pH7.2)、KCN肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,于36℃培養(yǎng)24h。

2.3.5 PCR確證試驗(yàn)

使用1μL接種環(huán)刮取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落,懸浮于200μL滅菌雙蒸水中,充分打散制成菌懸液,13000r/min離心3min,棄掉上清液。加入50μL充分震蕩混勻的核酸提取液,于100℃金屬浴維持10min,13000r/min離心3min,收集上清液,取2μL作為PCR檢測(cè)的模板。

3.結(jié)果與分析

3.1 平板分離結(jié)果結(jié)果如下

編號(hào) 麥康凱(MAC)培養(yǎng)基 伊紅美藍(lán)(EMB)15-1 桃紅色、濕潤(rùn)、圓形菌落;淡粉色、濕潤(rùn)、圓形菌落中心紫黑色帶金屬光澤;部分中心紫黑色不帶金屬光澤15-2 桃紅色、濕潤(rùn)、圓形菌落;淡粉色、濕潤(rùn)、圓形菌落中心紫黑色帶金屬光澤;部分中心紫黑色不帶金屬光澤

3.2 可疑菌落生化鑒定結(jié)果如下

注:“-”表示無(wú)生長(zhǎng),“+”表示生長(zhǎng)。10個(gè)可疑菌落生化結(jié)果相同。

3.3 可疑菌落PCR確證試驗(yàn)結(jié)果如下

注:“-”表示無(wú)條帶或曲線,“+”表示有條帶或曲線。

4.討論與分析

本實(shí)驗(yàn)室自2014起,參與國(guó)家食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目,并開(kāi)始使用多重PCR技術(shù),對(duì)五種致瀉大腸埃希氏菌進(jìn)行檢測(cè)。GB4789.6-2016自2017年6月23日?qǐng)?zhí)行以來(lái),也是食品微生物學(xué)檢驗(yàn)系列國(guó)標(biāo)中,首個(gè)細(xì)菌使用PCR做確證的標(biāo)準(zhǔn)。河南省疾病預(yù)防控制中心對(duì)全省各地市進(jìn)行了質(zhì)控考核,了解各實(shí)驗(yàn)室對(duì)該技術(shù)掌握的程度以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平。

傳統(tǒng)的血清學(xué)分型,操作繁瑣,技術(shù)人員要求高,且檢驗(yàn)結(jié)果并不能作為是否有致病能力的依據(jù),只能說(shuō)某個(gè)血清型可能與致病相關(guān)。血清學(xué)鑒定的137株致瀉大腸中僅有15株(10.9%)為正確鑒定,僅采用血清學(xué)分類是不夠的[3]。與傳統(tǒng)血清試驗(yàn)相比較而言,用PCR方法進(jìn)行確證,操作簡(jiǎn)單,對(duì)操作人員要求不高,且提高致病菌檢出率及檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性,同時(shí)縮短了致病菌的檢驗(yàn)時(shí)間。隨著快速檢驗(yàn)方法的發(fā)展,快速檢驗(yàn)因其優(yōu)點(diǎn)快速發(fā)展,在突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處理中,發(fā)揮積極作用,但快速方法也存在其缺點(diǎn),快速檢驗(yàn)一般從基因著手,檢測(cè)到致病菌并未獲得其菌株,容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此,在面對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí),應(yīng)該靈活運(yùn)用,將快檢方法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合,快速準(zhǔn)確地得出實(shí)驗(yàn)室結(jié)果,為相關(guān)部門(mén)處理問(wèn)題提供可靠依據(jù)。該實(shí)驗(yàn)室在此質(zhì)控過(guò)程中使用了兩種多重PCR方法來(lái)進(jìn)行確證試驗(yàn),相互印證結(jié)果,兩種方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)時(shí)熒光多重PCR優(yōu)點(diǎn)在于將PCR擴(kuò)增與結(jié)果判定結(jié)合一起,操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,污染少。普通PCR試驗(yàn)后,需要進(jìn)行電泳試驗(yàn)并用凝膠成像儀觀察結(jié)果,操作繁瑣,試驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng),存在污染環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[4]。

[1] 李凡, 劉晶星. 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)(第七版)[M]. 北京∶人民衛(wèi)生出版社, 2012.

[2] 世界衛(wèi)生組織. 麻疹實(shí)況報(bào)道. 2017-03.

[3] GB4789.6-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué) 致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗(yàn)》[s].

[4] J Yang ,FJWu, J Mu,L Lin ,et al.Comparison between O Serotyping Method and Multiplex Real-Time PCR To Ⅰdentify Diarrheagenic Escherichia coli inTaiWan [J].《Journal of Clinical Microbiology》, 2007, 45(11) ∶3620-3625

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