劉百川 何靈生 張煦 張濤 邱曉拂 李高遠 陳波特 楊國勝

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，膀胱癌對紫杉醇等化療藥物敏感，但紫杉醇有難溶于水、半衰期短及毒性大等缺點，因此紫杉醇在臨床上的應用受到了限制。目前國內(nèi)外市面銷售的紫杉醇注射液，是將紫杉醇溶解于吐溫中，該制劑臨床用藥不便，安全性低；口服給藥雖可提高患者的順應性，但低的水溶解度和胃腸道的外排作用，使紫杉醇的口服生物利用度非常低。因此，開展對膀胱癌的生物特性的研究，確立防治靶點，尋求新的治療方式對提高膀胱癌的療效具有一定的重要性。

文獻報道紫杉醇可通過不同的凋亡機制發(fā)揮作用，如下調(diào)Bcl-2和Bcl-xL表達，并導致細胞周期停滯在G2/M期[1]。有報道羅勒多糖聯(lián)合紫杉醇可使A549細胞內(nèi)鈣離子濃度提高，造成線粒體膜電位下降，使細胞周期停滯在G2/M及S期，導致細胞凋亡的增加[2]。因此，紫杉醇可以以聯(lián)合治療方式來抑制癌細胞的生長。噬菌體肽庫展示技術近幾年來得到迅速發(fā)展，成為生物學研究和應用領域中有效而重要的工具。目前已知的有膀胱腫瘤導向多肽RGD序列、NVVRQ序列和CSNRDARRC序列(膀胱癌) 等[3-6]。這些多肽在膀胱腫瘤學的研究中具有重要意義。多肽在今后的臨床診斷和治療中都具有廣闊的前景。已有研究表明，肽段CSNRDARRC與膀胱癌細胞T24能夠特異性結合，在膀胱腫瘤細胞中是重要的配體肽段[4]。

聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)是一個性能優(yōu)良的乳化劑，TPGS能顯著提高藥物在PLGA納米顆粒中的包封率。TPGS能通過阻斷P-糖蛋白活性而增強藥物的吸收和治療效果，并且有效促進細胞凋亡、提高抗腫瘤活性，另外藥物與TPGS合用后能明顯增加胃腸道內(nèi)的吸收，提高其生物利用度[7-13]。

隨著納米技術的開發(fā)研究，尤其是納米藥物制劑的發(fā)展，其在癌癥治療中顯示出巨大的潛力和優(yōu)越性，由于生物可降解聚合物納米顆粒在口服給藥后具有主動和被動的靶向治療作用，因此，本實驗擬采用雙靶向多肽CSNRDARRC-PCL-PGA/TPGS載藥納米顆粒來治療膀胱癌，通過CSNRDARRC-PCL-PGA與TPGS形成共混膠束，利用TPGS能抑制P-糖蛋白的外排作用來提高藥物吸收的效率，增加靶器官藥物濃度，為膀胱癌的治療開辟新途徑。

材料與方法

一、實驗材料

TPGS[C33O5H54(CH2CH2O)23]及聚己內(nèi)酯(分子量=41 000 Da)和辛酸亞錫[Sn(OOCC7CH15)2][購于西格瑪-奧爾德里奇(圣劉易斯)]；TPGS-b-(PCL-ran-PGA)嵌段共聚物(分子量=25 000 Da)和純度為99.9%的紫杉醇[購于Nano Med生物技術有限公司(中國深圳)]；配體肽段CSNRDARRC，由半胱氨酸-絲氨酸-天冬酰胺-精氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸組成的氨基酸序列(上海肽仕生物公司合成)；胎牛血清[購于Gibco(瑞典生物技術公司)]；甲醇和乙腈[購于EM Science (馬林克羅貝克)]；去離子水(由密理博公司的純水系統(tǒng)制備)；RT112、T24及SV-HUC-1細胞[購于American Type Culture Collection (Manassas, VA)]。

二、載有紫杉醇的多肽配體-PCL-PGA/TPGS共聚物的納米顆粒的制備

應用溶劑萃取/蒸發(fā)法制備納米顆粒[14]。取11 mg 的紫杉醇粉末和100 mg的TPGS-b-(PCL-ran-PGA)嵌段共聚物，溶解于二氯甲烷中。隨后倒入TPGS(0.03% w/v)溶液中并溫和攪拌。在常溫條件，靜置水油乳濁液過夜。80 000×g離心收集納米顆粒，將收集到的納米顆粒懸浮于去離子水中，凍干。之后TPGS-b-(PCL-ran-PGA)納米顆粒按照文獻報道的方法與多肽配體修飾。先將多肽配體配制成0.5 mg/ml的去離子水溶液，然后納米顆粒以9.5 mg/ml的濃度懸浮于多肽配體水溶液中，在冰浴條件下超聲波處理溶液，最后80 000×g離心20 min 收集納米顆粒，即為多肽紫杉醇NP。

三、納米顆粒的表征

1.納米顆粒的大小和表面電動勢測定：通過動態(tài)光散射測定納米顆粒的平均直徑和顆粒大小分布范圍，所用的儀器是Malvern Zeta sizer Nano-ZS90(馬爾文儀器有限公司)。納米顆粒表面的電荷利用激光多普勒風速測量，所用的儀器是Zeta sizer Nano Series instrument (馬爾文儀器有限公司)。所有的測量均進行3次驗證。

2.納米顆粒的形態(tài)表征：將納米顆粒溶液放置于400目碳包埋的銅網(wǎng)上，隨后通過發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM; Zeiss 77 SUPRA 40VP)檢測其納米顆粒的形態(tài)。

3.藥物裝載和包埋效率測試：采用高效液相色譜(HPLC)法檢測取出的釋放藥物介質中紫杉醇的含量。取干燥的5 mg納米顆粒溶解于二氯甲烷中，然后轉移到流動相中(乙腈/去離子水，v/v=50∶50)，將上述樣品進行HPLC分析。隨后于紫外可見光探測器下監(jiān)測，納米顆粒攝取藥物的能力定義為最終產(chǎn)物中藥物裝載的百分比。所有的實驗均重復3次。

4.體外藥物釋放實驗：取15 mg裝載有藥物的納米顆粒，將其懸浮在5 ml的釋放介質中(PBS 7.4 含有 0.1% w/v Tween80)。將納米顆粒懸浮物轉移到透析袋，浸潤在釋放介質的離心管中。將離心管放置37 °C水浴鍋，并以130 rpm速度旋轉。每10 min取出樣品，經(jīng)由HPLC分析。后續(xù)的分析測試方法與測定藥物攝取效率的方法相同。

四、細胞培養(yǎng)

將RT112、T24及SV-HUC-1細胞培養(yǎng)于37 °C，5% CO2的組織培養(yǎng)液中。所用的培養(yǎng)液(DMEM)添加了100g/ml鏈霉素和20%胎牛血清，平均每2 d更換一次培養(yǎng)液。待細胞生長到70%～90%左右，用0.25%的胰蛋白酶-乙烯基聯(lián)氨四乙酸溶液(Invitrogen)消化細胞，進行細胞傳代。

五、藥物毒性試驗

將RT112、T24及SV-HUC-1細胞以每孔5 000個細胞的密度鋪板在96孔細胞培養(yǎng)板上過夜。選定紫杉醇作為測試的轉載抗腫瘤模式化合物。RT112細胞在同等濃度(10 mg/L)紫杉醇下分別與多肽紫杉醇-PCL-PGA/TPGS納米顆粒懸浮物(多肽紫杉醇NP)、裝載紫杉醇的TPGS-b-(PCL-ran-PGA)納米顆粒懸浮物(紫杉醇NP)、PCL-PGA/TPGS納米顆粒懸浮物(NP)以及未裝載紫杉醇的多肽TPGS-b-(PCL-ran-PGA)納米顆粒懸浮物(多肽NP)培養(yǎng)液共培育12、24和48 h。在達到設定共培育時間之后，用新鮮的含有MTT(5 mg/ml)DMEM培養(yǎng)液替代含有納米顆粒的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后吸走含有MTT的培養(yǎng)液，并加入150 ml DMSO溶解三苯基甲酯形成的晶體，用酶標儀(model 680, Bio-Rad Laboratories, United Kingdom)測定每一個孔在570 nm的吸收。未處理組(Control組)的吸收光強度作為細胞100%活性的標準，無添加MTT的細胞孔作為Blank用來計算熒光分光亮度計在0的吸收值。上述實驗結果用平行實驗結果的平均值±資料的標準偏差來表示，每次實驗重復3次。

六、細胞周期分析

將RT112細胞以每孔1×105個細胞的密度鋪板在6孔細胞培養(yǎng)板上過夜, 隔天加入RT112細胞,在同等濃度(10 mg/L)紫杉醇下分別與多肽載藥NP、載藥NP以及多肽空NP，于培養(yǎng)液共培育12 h。在達到24 h后，利用0.25%胰酶消化后分別進行PI染劑(0.3% TRIPTON X-100, 25 mg/ml PI, 0.1 mmol/L EDTA 及 10 mg/ml RNase 溶于 PBS))染色30 min，隨后利用流式細胞儀進行分析(Becton Dickinson, BD)。

七、細胞凋亡分析

1.DAPI細胞核染色:將細胞經(jīng)由4%多聚甲醛固定10 min，隨后DAPI染色10 min，在熒光顯微鏡上觀察。

2.Annexin V/PI染色:用胰酶將細胞消化后分別進行Annexin V 及 PI染色 (Dead Cell Apoptosis Kit, Invitrogen, V13241)，隨后利用流式細胞儀進行分析(Becton Dickinson, BD)。

3.腺粒體膜電位分析:將細胞經(jīng)過胰酶消化后，利用JC-1染色15 min (Dead Cell Apoptosis Kit, Invitrogen, V13241)，在熒光顯微鏡上觀察。

以上實驗的細胞鋪板及納米顆粒處理參考細胞周期分析方法。

八、統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計學處理，用T檢驗法及方差分析來驗證變數(shù)平均值的可信性。實驗數(shù)據(jù)在P<0.05情況下才被視為有可信性。

結 果

一、負載紫杉醇膠束的表征

1.大小及電勢：通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)多肽紫杉醇NP呈窄單分散，平均流體力學直徑在255.3 nm左右(圖1A)。而透射電鏡的結果顯示多肽紫杉醇NP是分布均一的球形顆粒，粒徑在240～260 nm (圖1B)。Z電勢測試結果印證了通過多肽修飾的紫杉醇NP能夠減少納米顆粒表面的負電荷(表1)。沒有修飾的納米顆粒表面電荷為-20.2 mV，修飾了多肽后，納米顆粒表面電荷為-11.2 mV。負電荷減少，可以較TPGS-b-(PCL-ran-PGA)更容易進入細胞。

表1 負載紫杉醇納米顆粒特征

A：粒徑分布；B：透射電鏡圖

圖1 多肽紫杉醇NP粒徑大小及電勢

2.藥物釋放行為：通過HPLC測得多肽紫杉醇NP的載藥量為(8.36±0.05)%(表1)。紫杉醇NP及多肽紫杉醇NP具有相似的紫杉醇釋放模式，開始基本都是爆發(fā)式的釋放(圖2)，之后釋放紫杉醇的速度變緩直到接近于0。紫杉醇NP在40 h釋放了28.87%的紫杉醇，在120 h釋放了41.58%的紫杉醇。多肽紫杉醇NP在40 h釋放了33.87%的紫杉醇，在120 h釋放了45.48%的紫杉醇。

圖2 負載紫杉醇鈉米顆粒藥物釋放情況

二、多肽紫杉醇顆粒抑制膀胱癌細胞增殖

在同等濃度(10 mg/L)紫杉醇下RT112及T24分別與多肽紫杉醇NP、紫杉醇NP、多肽顆粒以及空NP于培養(yǎng)液共培育12、24和48 h。紫杉醇NP及多肽紫杉醇NP皆有時間依賴性，隨著時間的增加， RT112及T24細胞存活率降低，而且多肽紫杉醇NP優(yōu)于紫杉醇NP。而空NP以及多肽NP皆無毒性。細胞活性試驗結果(多肽紫杉醇NP組>紫杉醇NP組)與培育時間相關。這可能是與納米顆粒持續(xù)和可控的藥物釋放方式有關系。多肽NP對SV-HUC-1膀胱上皮細胞無毒性，多肽紫杉醇NP雖然對SV-HUC-1膀胱上皮細細有些許毒性，但相對于RT112膀胱癌細胞而言，多肽紫杉醇NP毒性還是相對大一點。多肽紫杉醇NP能夠有效抑制膀胱癌細胞增殖。

三、多肽紫杉醇NP調(diào)控RT112膀胱癌細胞的細胞周期分析

經(jīng)多肽紫杉醇NP、紫杉醇NP以及多肽NP處理后， PI染色顯示，在10 mg/L濃度的紫杉醇下， RT112細胞經(jīng)由紫杉醇NP處理后，G2/M期增加至28.02%；而多肽紫杉醇NP處理后，G2/M期增加至48.03%，結果證明多肽紫杉醇NP能使細胞停滯在細胞周期的G2期，與多肽紫杉醇NP影響細胞存活率結果一致。見圖3。

A：空NP；B：紫杉醇NP;C:多肽紫杉醇NP

圖3 負載紫杉醇納米顆粒對RT112細胞周期的影響

四、多肽紫杉醇NP造成膀胱癌細胞RT112細胞凋亡

從細胞存活結果發(fā)現(xiàn)紫杉醇NP會造成RT112細胞的存活率下降，因此我們推測紫杉醇NP可能引發(fā)細胞凋亡，我們使用Annex V/PI染色來觀察紫杉醇NP對RT112細胞的影響。RT112細胞經(jīng)由紫杉醇NP處理后有些細胞核濃縮片斷化；而在多肽紫杉醇NP處理后細胞核濃縮片斷化更明顯，符合細胞凋亡的表觀現(xiàn)象。見圖4A。Annex V/PI染色顯示，紫杉醇NP處理后細胞凋亡發(fā)生增加至37.5%，而在多肽紫杉醇NP處理后細胞凋亡增加至68.0%。見圖4B。證明多肽紫杉醇NP引起的細胞凋亡較紫杉醇NP更有效，多肽紫杉醇NP較紫杉醇NP更能促進細胞凋亡。

A：DAPI染色；B：Annex V/PI 染色

圖4 負載紫杉醇納米顆粒對RT112細胞凋亡的影響

五、腺粒體膜電位下降引起細胞凋亡

利用JC-1染色分析紫杉醇NP是否可通過改變腺粒體膜電位而造成細胞凋亡。實驗結果顯示，RT112細胞經(jīng)紫杉醇NP處理后，紅色熒光減少，綠色熒光增多；而在多肽紫杉醇NP處理后，紅色熒光急速下降，綠色熒光明顯增加，細胞色素C釋放到細胞質中，有凋亡發(fā)生。見圖5。

圖5 負載紫杉醇納米顆粒導致線粒體膜電位改變而造成凋亡

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，大多膀胱癌患者使用紫杉醇等化療藥物進行治療。但紫杉醇有難溶于水、半衰期短及副作用大等缺點。目前膀胱癌導向多肽在膀胱癌的研究中具有重要意義，如已知的膀胱癌導向多肽RGD序列、NVVRQ序列和CSNRDARRC序列[4-6]，多肽在今后的臨床診斷和治療中都具有廣闊的前景。已有研究表明，肽段CSNRDARRC可與T24膀胱癌細胞進行特異性結合，是膀胱腫瘤細胞研究中重要的配體肽段[4]。 為了改善紫杉醇的缺點，我們利用CSNRDARRC多肽負載紫杉醇來治療膀胱癌。

多肽-PCL-PGA/TPGS的合成較困難，因PCL是疏水核，不易與多肽連結。為此我們使用多肽TPGS-b-(PCL-ran-PGA) (多肽NP)和紫杉醇復合，得到了負載紫杉醇多肽的膠束TPGS-b-(PCL-ran-PGA) (多肽紫杉醇NP)。從圖1發(fā)現(xiàn)多肽紫杉醇NP呈窄單分散，平均流體力學直徑在255.3 nm左右，粒徑在240～260 nm。通過ICP-MS，我們測得多肽紫杉醇NP的載藥量約為(8.36±0.05)%(表1)，可能是由于多肽紫杉醇的親水性更好并且分子量較紫杉醇NP小，導致共聚物膨大并且被降解的速度更快，從而加速了紫杉醇從載體中釋放。

細胞毒性實驗顯示，多肽紫杉醇NP組>紫杉醇NP組且與培育時間呈依賴性，這可能是與納米顆粒持續(xù)和可控的藥物釋放方式有關系。根據(jù)紫杉醇能導致細胞周期停滯在G2/M期的報道，結合細胞毒性實驗結果，我們認為多肽紫杉醇NP可能會影響細胞周期，從圖3發(fā)現(xiàn)多肽紫杉醇NP的確能夠使細胞停滯在細胞周期的G2期，這也與多肽紫杉醇NP影響細胞存活率結果一致。經(jīng)由細胞存活率的結果可以推測多肽紫杉醇NP可能會造成細胞凋亡。

由于早期凋亡細胞呈現(xiàn)核濃縮，經(jīng)由DAPI染色加深后核染色質會呈現(xiàn)新月形并聚集于核膜一邊，晚期凋亡時，細胞會出現(xiàn)核碎裂呈大小不等的圓形小體，并被細胞膜所包圍，即凋亡小體，因此利用DAPI染色來觀察細胞凋亡[15]。從圖4發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由紫杉醇NP處理后有些細胞核濃縮片斷化；而在多肽紫杉醇NP處理后細胞核濃縮片斷化更明顯，因此符合細胞凋亡的表觀現(xiàn)象。利用Annex V/PI染色也驗證紫杉醇NP能使細胞的凋亡情況增加，多肽紫杉醇NP引起的細胞凋亡較紫杉醇NP更有效。

細胞凋亡屬于程序性死亡，不同的刺激會啟動不同的信號通路而促發(fā)凋亡。目前較為經(jīng)典的信號有兩條:Fas-FasL及caspase啟動的信號通路[16-17]。其中，caspase信號通路會破壞腺粒體膜的完整性，使細胞色素C從腺粒體內(nèi)釋放到細胞質中，啟動下游的caspase通路，最終引起凋亡發(fā)生[18]。當腺粒體膜完整時，JC-1會被吸入進腺粒體中，形成JC-1聚合物，發(fā)射紅色熒光；但腺粒體膜被破壞后，造成膜電位下降，此時JC-1會分散在細胞質中，而發(fā)出綠色熒光，因此可以從JC-1染色來驗證細胞凋亡的通路[19]。從JC-1染色來驗證多肽紫杉醇NP對細胞凋亡的通路。從圖5結果發(fā)現(xiàn)，RT112細胞經(jīng)多肽紫杉醇NP處理后，紅色熒光急速下降，綠色熒光明顯增加，細胞色素C釋放到細胞質中，有凋亡發(fā)生的現(xiàn)象。

本研究成功合成了負載紫杉醇多肽-PCL-PGA/TPGS納米顆粒，通過CSNRDARRC-PCL-PGA與聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS)形成共混膠束，這種表面TPGS包覆的納米載體具有很強的穩(wěn)定性，并且多肽CSNRDARRC具有雙靶向，能夠通過納米載體的方式來抑制RT112細胞生長，造成RT112膀胱癌細胞細胞周期停滯，并且通過腺粒體膜電位下降而引起細胞凋亡。綜合以上結果我們發(fā)現(xiàn)，負載紫杉醇多肽-PCL-PGA/TPGS納米顆粒載體為膀胱癌的治療提供了一個新手段，可作為治療膀胱癌的一種潛力藥物。

[1] Yang CH， Horwitz SB. Taxol(R): The First Microtubule Stabilizing Agent[J]. Int J Mol Sci,2017,18(8). doi: 10.3390/ijms18081733.

[2] 李路,楊軍,李蘭,等. 羅勒多糖聯(lián)合紫杉醇對 A549 細胞線粒體膜電位和細胞周期的影響[J]. 中南藥學,2016,(5)：471-475.

[3] Xiao M， Hong Z， Sun L， et al. TMTP1, a Novel Tumor-homing Peptide, Specifically Targets Hematological Malignancies and Their Metastases[J]. J Huazhong U Sci-Med,2011,31(5):608-613.

[4] Jia XY, Yu Q, Zhang ZH, et al. Targeting bladder tumor cells in voided urine of Chinese patients with FITC-CSNRDARRC peptide ligand[J]. Onco Targets Ther,2012,5:85-90.

[5] Yao VJ, D'Angelo S, Butler KS, et al. Ligand-targeted theranostic nanomedicines against cancer[J]. J Control Release,2016,240:267-286.

[6] Yang XF, Pang JZ, Liu JH, et al. Homing Peptide Guiding Optical Molecular Imaging for the Diagnosis of Bladder Cancer[J]. Proc Spie,2014,(96281)：1-12.

[7] Dintaman JM, Silverman JA. Inhibition of P-glycoprotein by D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS)[J]. Pharm Res,1999,16(10):1550-1556.

[8] Yang C, Wu T, Qi Y, et al. Recent Advances in the Application of Vitamin E TPGS for Drug Delivery[J]. Theranostics,2018,8(2):464-485.

[9] Sun Y, Yu B, Wang G, et al. Enhanced antitumor efficacy of vitamin E TPGS-emulsified PLGA nanoparticles for delivery of paclitaxel[J]. Colloids Surf B Biointerfaces,2014,123:716-723.

[10] Mu L, Feng SS. A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS[J]. J Control Release,2003,86(1):33-48.

[11] Watanabe T, Miyauchi S, Sawada Y, et al. Kinetic-Analysis of Hepatobiliary Transport of Vincristine in Perfused-Rat-Liver - Possible Roles of P-Glycoprotein in Biliary-Excretion of Vincristine[J]. J Hepatol,1992,16(1-2):77-88.

[12] Choudhury H, Gorain B, Pandey M, et al. Recent advances in TPGS-based nanoparticles of docetaxel for improved chemotherapy[J]. Int J Pharmaceut,2017,529(1-2):506-522.

[13] Duhem N, Rolland J, Riva R, et al. Tocol modified glycol chitosan for the oral delivery of poorly soluble drugs[J]. Int J Pharm,2012,423(2):452-460.

[14] Ma Y, Zheng Y, Zeng X, et al. Novel docetaxel-loaded nanoparticles based on PCL-Tween 80 copolymer for cancer treatment[J]. Int J Nanomedicine,2011,6:2679-2688.

[15] Huerta S, Goulet EJ, Huerta-Yepez S, et al. Screening and detection of apoptosis[J]. J Surg Res,2007,139(1):143-156.

[16] Elmore S. Apoptosis: A review of programmed cell death[J]. Toxicol Pathol,2007,35(4):495-516.

[17] Ouyang L, Shi Z., Zhao S, et al. Programmed cell death pathways in cancer: a review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis[J]. Cell Prolif,2012,45(6):487-498.

[18] Jiang X, Wang X. Cytochrome C-mediated apoptosis[J]. Annu Rev Biochem,2004,73:87-106.

[19] Kroemer G, Reed JC. Mitochondrial control of cell death[J]. Nat Med,2000,6(5):513-519.