劉孝德 張鵬

膀胱癌發(fā)病率高居我國泌尿系統(tǒng)腫瘤第一位。2015年我國膀胱癌新發(fā)病例8.05萬，死亡病例3.29萬[1]。膀胱癌的病因復(fù)雜，既涉及外在環(huán)境因素，例如飲食、吸煙及接觸致癌物質(zhì)等[2-3]，又涉及內(nèi)在遺傳因素，例如基因多態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性是指隨機(jī)婚配的群體中，不同個體間同一基因位點存在兩種或多種不連續(xù)的基因型。按照被關(guān)注的前后順序，通常分為三大類：DNA重復(fù)序列多態(tài)性、長度多態(tài)性和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。SNP是指基因組序列中單堿基變異造成的序列多態(tài)性，在人類基因組中廣泛存在。SNP在不同人群和不同疾病狀態(tài)中分布不同，其對研究疾病病因、病理進(jìn)程和預(yù)后等具有重要的指導(dǎo)意義。

microRNA(miRNA)是長度約為18～24個核苷酸的微小RNA，本身不編碼蛋白質(zhì)，但是可通過靶向mRNA發(fā)揮基因調(diào)控功能，參與多種腫瘤包括膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。多項研究證實，膀胱癌中miR-143和miR-145呈顯著低表達(dá)[4-6]。人類miR-143和miR-145以簇的形式存在，具有共同的啟動子區(qū)。最近有報道稱，miR-143/145啟動子區(qū)SNP位點rs4705341與中國人群結(jié)直腸癌的發(fā)病相關(guān)[7]。本研究選取青海地區(qū)漢族人群作為研究對象，運用病例-對照方法探討rs4705341多態(tài)性與膀胱癌易感性的關(guān)系。

對象與方法

一、研究對象

病例組由我院泌尿外科收治的106例膀胱癌患者組成，入組病例術(shù)前未接受放化療，術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實為膀胱癌。對照組為162例同時期于我院行健康體檢者，經(jīng)B超檢查證實膀胱無異常。所有研究對象均為漢族，均否認(rèn)腫瘤家族史，無生物學(xué)親緣關(guān)系。使用乙二胺四乙酸鈉抗凝管采集所有研究對象外周靜脈血2～3 ml，-20 ℃保存。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

病例組和對照組研究對象平均年齡分別為(58.8 ±9.7)歲和(57.1±10.0)歲。兩組男女性別比一致，約為3∶2。年齡和性別分布上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.16和0.21)。病例組中，40.6%患者為非肌層浸潤性膀胱癌，45.3%患者為低分級膀胱癌。病例組和對照組研究對象一般情況見表1。

表1 病例組和對照組研究對象一般情況比較 [均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n(%)]

項目對照組病例組P值年齡 (歲)57.1±10.058.8±9.70.16性別 男93(57.4)69(65.1)0.21 女69(42.6)37(34.9)膀胱癌浸潤程度 非肌層浸潤性43(40.6) 肌層浸潤性63(59.4)膀胱癌惡性程度 低分級48(45.3) 高分級58(54.7)

二、基因分型

應(yīng)用北京百泰克公司DNA抽提試劑盒提取全血基因組DNA。運用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性長度片段多態(tài)性檢測 rs4705341 基因型，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]合成引物(上海生工生物工程有限公司)：上游：5’-CCTCGGCTTCCCAAAGTGATC-3’,下游：5’- TCCCAGCCAGATAACTGCTTTCC-3’。反應(yīng)體系如下：2×PCR反應(yīng)混合物5 μl，上、下游引物混合物10 μmol/L，DNA模板1 μl，加超純水至10 μl。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35個循環(huán))；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由限制性內(nèi)切酶 Bcl Ⅰ(NEB公司，美國)于50 ℃水浴孵育過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。rs4705341 A等位基因有一個限制性內(nèi)切酶識別位點，酶切后產(chǎn)生2個片段，分別為106 bp和17 bp；rs4705341 G等位基因無限制性內(nèi)切酶識別位點，酶切后僅有1個123 bp片段。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。病例組和對照組年齡分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異比較采用t檢驗。哈迪-溫伯格平衡和rs4705341多態(tài)性相關(guān)性比較采用χ2檢驗。非條件logistic回歸模型計算調(diào)整年齡和性別后優(yōu)勢比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

檢測到miR-143/145啟動子區(qū) rs4705341 三種基因型，分別為AA、AG和GG(圖1)，其在病例組和對照組中的分布頻率均符合哈迪-溫伯格平衡，P值分別為0.81和0.14。rs4705341 GG基因型在病例組中的頻率(8.5%)明顯低于對照組(19.1%)，經(jīng)年齡和性別調(diào)整后，OR值為0.34，95%CI：0.15～0.78，P值為0.007。等位基因?qū)Ρ戎幸嘤^察到rs4705341降低膀胱癌的風(fēng)險(G與A對比：OR=0.60，95%CI：0.41～0.87，P=0.007)。見表2。分層分析顯示，rs4705341與膀胱癌浸潤程度和惡性程度不存在相關(guān)性。

圖1 rs4705341電泳圖

表2 miR-143/145啟動子區(qū)rs4705341與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系 [n(%)]

討 論

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展不僅與編碼基因的激活或失活有關(guān)，而且與非編碼RNA的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。miRNA是一類長約18～24個核苷酸的小分子非編碼RNA，在膀胱癌中存在差異性表達(dá)，例如miR-143和miR-145可通過調(diào)控多條細(xì)胞信號途徑抑制膀胱癌的發(fā)生[4-6]。體外和體內(nèi)實驗均顯示，過表達(dá)miR-143或miR-145可靶向結(jié)合多個靶基因抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，延長裸鼠生存時間，并增加細(xì)胞對順鉑和吉西他濱等化療藥物的敏感性[8-13]。由此認(rèn)為，miR-143和miR-145有望成為膀胱癌新的治療靶點。

然而，并非所有低表達(dá)miR-143和/或miR-145的個體均能罹患膀胱癌，提示miR-143/145相關(guān)的SNP可能是不同個體不同易感性的原因之一。以往研究顯示，SNP不僅與膀胱癌的易感性、藥物的敏感性有關(guān)，而且與膀胱癌的分期分級等臨床特征相關(guān)[14-15]，已成為種群遺傳分析、疾病易感性和藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域中的重要遺傳標(biāo)志。最近有報道顯示，位于miR-143/145啟動子區(qū)的SNP rs4705341 GG基因型攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險下降0.66倍，并且預(yù)示有更長的總體生存期[7]。與該研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs4705341 GG基因型的個體患膀胱癌的風(fēng)險降低了0.34倍，等位基因?qū)Ρ戎幸喟l(fā)現(xiàn)該保護(hù)效應(yīng)，提示rs4705341 GG基因型可能是膀胱癌發(fā)病的一個保護(hù)因素。

對于其可能的機(jī)制，有研究應(yīng)用TRANSFAC軟件預(yù)測rs4705341與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)rs4705341 G等位基因可與轉(zhuǎn)錄因子GAL4結(jié)合，而A等位基因則不能。GAL4與抑癌基因p53具有相似的酸性結(jié)構(gòu)域，兩者重組為融合蛋白可激活p53第20～40密碼子，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[16]。由此推測，rs4705341 GG基因型降低膀胱癌發(fā)病風(fēng)險的可能機(jī)制是G等位基因結(jié)合了轉(zhuǎn)錄因子GAL4，促進(jìn)miR-143和/或miR-145的轉(zhuǎn)錄，使得miR-143和/或miR-145表達(dá)量增加，發(fā)揮抑癌作用。其準(zhǔn)確機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究初步證實miR-143/145啟動子區(qū)rs4705341 GG基因型攜帶者具有更低的膀胱癌患病風(fēng)險。但是，由于本研究樣本量較小，研究對象均為漢族個體，且地域來源單一等，可能存在一定偏倚，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量減少偏倚，以驗證本研究結(jié)果。

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