羅志遠(yuǎn)，周 宇，楊淇齡，黃 凱，唐 笑，武林華

( 1.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 廣西 南寧 530000； 2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院， 廣西 南寧 530000； 3.河池市水產(chǎn)畜牧局， 廣西 河池 547000 )

吉富羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus，GIFT)生長(zhǎng)速率快、遺傳性狀穩(wěn)定、出肉率高，我國(guó)羅非魚(yú)的人工養(yǎng)殖產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到世界第一位。肉堿能提高魚(yú)類的生產(chǎn)速率，提高成活率，減少脂肪肝的發(fā)生[1]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于肉堿在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究已有報(bào)道[2-4]，且在血液透析患者體內(nèi)L-肉堿水平研究上較為深入[5]。肉堿在水產(chǎn)畜牧飼料中的應(yīng)用較普遍[6-8]，但肉堿在畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究鮮有報(bào)道。筆者就肉堿經(jīng)口灌給藥的方式下，對(duì)相同規(guī)格羅非魚(yú)不同劑量肉堿及不同規(guī)格羅非魚(yú)體內(nèi)L-肉堿的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，以期為水產(chǎn)飼料中合理添加肉堿提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)對(duì)象為吉富羅非魚(yú)，由南寧引育種中心提供，不同劑量試驗(yàn)組中羅非魚(yú)體質(zhì)量為(82.72±3.65) g，不同規(guī)格試驗(yàn)組中羅非魚(yú)體質(zhì)量分別為(82.72±3.65) g、(413.83±39.92) g，健康無(wú)傷病。飼養(yǎng)用水為充分曝氣除氯的自來(lái)水，暫養(yǎng)及試驗(yàn)期間投喂全價(jià)顆粒料，日飼量為吉富羅非魚(yú)初始體質(zhì)量的2%，殘餌用虹吸管吸出。試驗(yàn)期間持續(xù)充氧并對(duì)水體進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾，每日早晚投喂吉富羅非魚(yú)配合飼料各1次，及時(shí)吸出殘餌和糞便，每2 d換水1/2。給藥與采樣前 3 d 停飼，處理期間不投喂飼料，持續(xù)保持充氣狀態(tài)。

1.2 試劑及儀器

肉堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)；魚(yú)旺四號(hào)(肉堿)(純度10%，杭州天農(nóng)生物營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)；乙腈(色譜純，Merck公司)；三乙胺(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；檸檬酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；磷酸氫二鈉(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(分析純，天津市博迪化工股份有限公司)；氧化銀(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑研發(fā)中心)；對(duì)溴苯乙酰基溴(p-BPB)(阿拉丁公司)；10%四丁基氫氧化銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；肝素鈉(南京新百藥業(yè)有限公司)。

UltiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng) (包括雙泵3200A，手動(dòng)進(jìn)樣器 3200，恒溫柱溫箱 330，可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器 3400RS)(Chromeleon戴安中國(guó)有限公司)；精密電子天平[豪斯儀器(上海)有限公司]；高速臺(tái)式離心機(jī)(Sigma 公司)；Vortex-Genie 2型漩渦混合器(美國(guó) Scientific Industries公司)；HW-100型恒溫水浴箱(南京泰斯特試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；5200DT型超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.3 溶液配制

L-肉堿貯備液：精密稱取肉堿標(biāo)準(zhǔn)品 16.1 mg，10 mL雙蒸水溶解，配制成10 mmol/L的肉堿儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆?，以此配制肉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。

衍生劑配制：精確稱取對(duì)溴苯乙?；?p-BPB)40 mg于試管中，依次加入乙腈1 mL、10%四丁基氫氧化銨100 μL，充分混勻，注意只能在當(dāng)日使用，避光存放。蛋白沉淀劑：乙腈∶甲醇=9∶1 (體積比)。

磷酸二氫鉀和氧化銀混合物：磷酸二氫鉀∶氧化銀混合物=9∶1 (質(zhì)量比)。

檸檬酸緩沖液的配置：稱取1.89 g檸檬酸 (C6H8O7·H2O) 于燒杯中，加入約400 mL超純水溶解混勻后，再加入超純水定容至500 mL。

1.4 給藥與樣品前處理

將試驗(yàn)魚(yú)分為(82.72±3.65) g組和(413.83±39.92) g組，再將(82.72±3.65) g魚(yú)隨機(jī)分為12 mg/kg劑量組和120 mg/kg劑量組；(82.72±3.65) g規(guī)格120 mg/kg劑量組，按120 mL/kg魚(yú)質(zhì)量劑量灌藥，而(413.83±39.92) g規(guī)格12 mg/kg劑量組，按12 mg/L劑量灌藥。以上3個(gè)試驗(yàn)組每組約有180尾魚(yú)。再將每個(gè)試驗(yàn)組分為15個(gè)小組，每小組有10尾魚(yú)，口腔灌藥給藥。具體操作為：將藥品搖勻后，用長(zhǎng)10 cm軟膠管自魚(yú)口插入胃中，用注射器將藥物灌入魚(yú)胃，無(wú)回吐者為試驗(yàn)對(duì)象保留。每組分為15個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣。給藥前，試驗(yàn)動(dòng)物禁食3 d，分別于口灌前(0 h)和給藥后0.083、0.13、0.20、0.25、0.33、0.5、1、2、4、8、12、24、36 h和48 h采樣，用經(jīng)肝素鈉潤(rùn)洗的注射器自尾靜脈采血1.0 mL，置于含0.1%肝素鈉處理過(guò)的離心管中混勻，4000 r/min，離心15 min。分離血漿，置于冰箱中-20 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6尾魚(yú)，做6個(gè)平行樣。

1.5 樣品測(cè)定方法

取空腹尾脈血3 mL，離心后取上清液300 μL，加1000 μL 10%甲醇—乙腈溶液，混勻后，加入400 mg無(wú)水磷酸氫二鈉+氧化銀(9∶1)和400 mg無(wú)水磷酸二氫鉀，立即劇烈振搖5 min，8000 r/min離心5 min，吸取上清液600 μL再加入衍生化試劑50 μL混勻后，70 ℃水浴90 min。冷卻后進(jìn)樣20 μL作HPLC分析。該法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是1～400 μmol/L，肉堿衍生物色譜峰面積與待測(cè)肉堿的濃度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.08376x+0.09663 (n=6，r2=0.9995)，回收率穩(wěn)定為88.16%～101.48%，平均回收率為95.83%，日內(nèi)變異系數(shù)為1.79%～5.56%，日間變異系數(shù)為9.83%～11.81%。

1.6 色譜條件及數(shù)據(jù)處理

色譜柱： Kromasil Sil 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相配制：乙腈—檸檬酸緩沖液(90∶10，體積比)，每1 L流動(dòng)相中含有 0.25 mL 三乙胺，在上機(jī)前流動(dòng)相及樣品均用0.45 μm 濾膜減壓過(guò)濾；流速1.2 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量20 μL。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 11.5 進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸分析，用 Microsoft Office Excel 2003 繪制藥—時(shí)曲線，采用WinNonlin 5.2軟件非房室模型統(tǒng)計(jì)矩方法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和模型擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量肉堿在吉富羅非魚(yú)血漿中的濃度

單次口灌肉堿后，羅非魚(yú)血漿中藥物濃度隨時(shí)間變化情況見(jiàn)圖1。兩種劑量羅非魚(yú)血漿中藥物濃度變化趨勢(shì)基本一致，即給藥后藥物濃度迅速上升，0.5 h達(dá)最大值；在達(dá)最大濃度后至4 h之間，藥物濃度以較大的速率下降，4～12 h藥物濃度下降速率稍慢。在12 h又明顯升高形成第二個(gè)峰，至48 h時(shí)肉堿濃度分別為1.0 μmol/L和0.73 μmol/L。較高劑量組魚(yú)血漿中的藥物濃度高于較低劑量組。

圖1 不同劑量單次口灌給藥后羅非魚(yú)體內(nèi)肉堿的藥—時(shí)曲線

2.2 不同劑量的肉堿在羅非魚(yú)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)比較

12 mg/kg和120 mg/kg劑量口灌單次給藥，有關(guān)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng) WinNonlin 5.2 藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析非房室模型的統(tǒng)計(jì)矩方法得出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(表1)。12 mg/kg劑量的肉堿經(jīng)口灌進(jìn)入魚(yú)體后，迅速進(jìn)入吸收部位，血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為0.5 h，達(dá)峰濃度為21.27 μmol/L。其消除半衰期為8.73 h，魚(yú)體對(duì)藥物的總清除率為0.10 L/h·kg-1，曲線下面積為 96.95 μmol/h·L-1。120 mg/kg劑量組口灌給藥肉堿的血藥濃度達(dá)峰時(shí)間、達(dá)峰濃度、消除半衰期、表觀分布容積、總體清除率、平均滯留時(shí)間分別為0.5 h、82.28 μmol/L、9.71 h、3.90 L/h·kg-1、0.28 L/h·kg-1、12.27 h。由表1可知，120 mg/kg劑量組的達(dá)峰濃度、藥時(shí)曲線下面積顯著高于12 mg/kg劑量組的達(dá)峰濃度和藥時(shí)曲線下面積(P<0.05)，兩者清除率和平均滯留時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同劑量肉堿單次口灌給藥后在吉富羅非魚(yú)體內(nèi)的藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=6，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.3 不同規(guī)格吉富羅非魚(yú)血漿中肉堿的含量

以相同劑量12 mg/kg的肉堿口灌不同規(guī)格的羅非魚(yú)后，羅非魚(yú)血漿中藥物濃度隨時(shí)間變化情況見(jiàn)圖2。由圖2可知，(82.72±3.65) g魚(yú)比(413.83±39.92) g的分布要稍快；(82.72±3.65) g魚(yú)0.5 h時(shí)到達(dá)峰值19.95 μmol/L，而(413.83±39.92) g 0.5 h時(shí)達(dá)到峰值為(22.38±0.51) μmol/L，(82.72±3.65) g魚(yú)峰濃度略低于(413.83±39.92) g；12 h時(shí)兩組又形成第二峰，24 h時(shí)二者基本處于同一水平，分別為1.73 μmol/L和1.61 μmol/L，以后二者在同一水平上波動(dòng)下降，至48 h時(shí)(82.72±3.65) g和(413.83±39.92) g羅非魚(yú)血藥濃度降至1.00 μmol/L和1.05 μmol/L。

圖2 單次口灌給藥后不同規(guī)格羅非魚(yú)體內(nèi)肉堿的藥—時(shí)曲線

2.4 不同規(guī)格吉富羅非魚(yú)血漿中肉堿的藥代動(dòng)力學(xué)比較

采用WinNonlin 5.2 藥代動(dòng)力學(xué)軟件的非房室模型統(tǒng)計(jì)矩原理對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2，其中達(dá)峰時(shí)間、達(dá)峰濃度為實(shí)測(cè)值，藥時(shí)曲線下面積用梯形法計(jì)算。由表2可知，(413.83±39.92) g魚(yú)和(82.72±3.65) g魚(yú)的達(dá)峰時(shí)間相同，(413.83±39.92) g消除相半衰期較長(zhǎng)、峰濃度較高；而(82.72±3.65) g魚(yú)的表觀分布容積比(413.83±39.92) g大，說(shuō)明肉堿在(82.72±3.65) g魚(yú)體內(nèi)的分布程度比(413.83±39.92) g魚(yú)廣泛；(413.83±39.92) g魚(yú)清除率低于(82.72±3.65) g魚(yú)，(82.72±3.65) g魚(yú)的平均滯留時(shí)間比(413.83±39.92) g長(zhǎng)。

表2 單次口灌給藥后不同規(guī)格羅非魚(yú)體內(nèi)肉堿的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=6，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

3 討 論

3.1 吉富羅非魚(yú)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)模型選擇及特征

試驗(yàn)經(jīng)過(guò)WinNonlin 5.2軟件計(jì)算，得出統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)，由于血藥濃度—時(shí)間出現(xiàn)明顯的多峰現(xiàn)象，而房室參數(shù)無(wú)法滿足肉堿藥代過(guò)程中客觀描述的要求，對(duì)肉堿藥代過(guò)程進(jìn)行客觀描述，因此本試驗(yàn)選擇客觀性較強(qiáng)的非房室模型進(jìn)行分析。在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)肌注和口灌恩諾沙星[9]，硫酸新霉素口灌吉富羅非魚(yú)[10]和甲基睪丸酮口灌羅非魚(yú)[11]的藥時(shí)曲線符合房室模型參數(shù)。而甲磺酸達(dá)氟沙星口灌銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[12]，氟苯尼考、氟苯尼考胺口灌及肌注克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[13]和褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)口灌噁喹酸[14]則采用了非房室模型統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)進(jìn)行分析，由此可見(jiàn)，藥物種類及研究對(duì)象不同影響房室模型的擬合。房室模型擬合的優(yōu)點(diǎn)是將復(fù)雜的生物問(wèn)題簡(jiǎn)單化，將其作為一種數(shù)據(jù)分析的手段推導(dǎo)出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為臨床用藥提供了基本規(guī)律。

本試驗(yàn)表明，肉堿劑量120 mg/kg時(shí)(82.72±3.65) g魚(yú)組肉堿在羅非魚(yú)體內(nèi)的分布最廣和肉堿在人體內(nèi)(藥時(shí)曲線下面積為3738.93 mmol·h/L、2284.27 μmol·h/L)報(bào)道不一致[15]，這可能與試驗(yàn)動(dòng)物和給藥劑量等有關(guān)。

試驗(yàn)結(jié)果表明在口灌給藥的方式下，12 mg/kg劑量(82.72±3.65) g魚(yú)組和120 mg/kg劑量(82.72±3.65) g魚(yú)組及12 mg/kg劑量(413.83±39.92) g組表觀分布容積為1.29 L/kg、3.9 L/kg、1.08 L/kg，大于1.0 kg/L，說(shuō)明肉堿有較強(qiáng)的組織穿透性。

口灌給藥下，以相同的劑量給藥，比較肉堿在未成熟(82.72±3.65) g魚(yú)和(413.83±39.92) g羅非魚(yú)體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)差異顯示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，(82.72±3.65) g魚(yú)和(413.83±39.92) g魚(yú)達(dá)峰時(shí)間均為0.5 h，但(82.72±3.65) g魚(yú)消除半衰期、清除率分別為8.73 h、0.10 L/kg·h-1；(413.83±39.92) g魚(yú)的半衰期、清除率分別為7.91 h、0.095 L/kg·h-1，可見(jiàn)(413.83±39.92) g魚(yú)消除速率較快。筆者認(rèn)為造成不同規(guī)格羅非魚(yú)對(duì)肉堿消除速度差異的原因可能是(413.83±39.92) g魚(yú)的腎臟排泄功能發(fā)育較未成熟(82.72±3.65) g魚(yú)完全，亦或(82.72±3.65) g魚(yú)相對(duì)于(413.83±39.92) g魚(yú)更易受肉堿的影響而使其功能降低，影響肉堿的代謝，消除速度較(413.83±39.92) g魚(yú)慢。

本試驗(yàn)中，以12 mg/kg劑量給羅非魚(yú)口服肉堿，消除半衰期為8.73 h，而以120 mg/kg劑量時(shí)，消除半衰期為9.71 h；120 mg/kg劑量組的消除半衰期小于12 mg/kg劑量組，這與甲基睪丸酮在羅非魚(yú)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果[16]類似。推測(cè)肉堿的劑量影響其在羅非魚(yú)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3.2 消除曲線多峰現(xiàn)象的探討

研究藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)是選擇藥物種類、劑量以及用藥周期重要依據(jù)，對(duì)確保人類的健康和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物藥理學(xué)研究發(fā)展空間和應(yīng)用前景較大。

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