田海軍

水產(chǎn)動(dòng)物生活在水環(huán)境中，其體內(nèi)微生物組成除了受自身機(jī)體內(nèi)在因素的影響，還易隨著來自外界環(huán)境與食物中的微生物入侵而發(fā)生改變。為了有效地對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的疾病進(jìn)行防治，可以采用外界添加益生菌的手段實(shí)現(xiàn)改善水產(chǎn)動(dòng)物生存的環(huán)境，平衡體內(nèi)的微生物群落的組成，增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)病原菌的抵抗能力，提高養(yǎng)殖成功率的目的。

微生態(tài)制劑“零耗氧活性菌”，由酵母細(xì)胞壁、生物多糖、生物抗菌肽、生物堿、苷類、蒽醌類及其還原衍生物和多種活性肽組成，具有提高免疫力、提高消化率、殺滅細(xì)菌真菌和原蟲、抵制病毒侵?jǐn)_等作用，是生物提高非特異性免疫的不可缺少的重要組成成分。與抗生素相比，具有高效、無耐藥性、無污染、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色環(huán)保的要求，是理想的抗生素替代品?！傲愫难趸钚跃本哂谢钚愿?、分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好和生物利用度高等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)通過在飼料中添加“零耗氧活性菌”，比較對(duì)鱸魚、鱖魚、白鰱、草魚、花鰱和青蝦的日平均增重、發(fā)病率、死亡率、餌料系數(shù)等生產(chǎn)性能影響，為“零耗氧活性菌”在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用“零耗氧活性菌”由無錫華海生物科技有限公司提供，批號(hào)蘇飼添字（2015）251015，陰涼、干燥處貯藏。

實(shí)驗(yàn)用菌株：柱狀屈橈桿菌、溶藻弧菌和溫和氣單胞菌均由中科院水生生物研究所生物制品工程技術(shù)研究中心購(gòu)買。

1.2 時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)：河南省信陽市燕尾島某養(yǎng)殖場(chǎng)。

試驗(yàn)時(shí)間：2015年3月25日-2015年4月25日。

1.3 “零耗氧活性菌”最小抑菌濃度的測(cè)定

采用微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定。把處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600≈0.5（細(xì)菌計(jì)數(shù)約106）的指示菌用LB培養(yǎng)液稀釋到OD600≈0.05，分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔90μL。將零耗氧活性菌用pH值6.0的0.1mol/L PBS倍比稀釋。各取10μL分別加入培養(yǎng)孔中，混勻，每組重復(fù)3個(gè)孔。設(shè)加LB培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，接種細(xì)菌的為陽性對(duì)照。置37℃培養(yǎng)箱孵育12h后取出，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)量培養(yǎng)液的OD600值，將完全抑制菌體生長(zhǎng)的最低蛋白濃度確定為最小抑菌濃度（MIC）。

表1 “零耗氧活性菌”對(duì)鱸魚、鱖魚生產(chǎn)性能的影響

表2 “零耗氧活性菌”對(duì)白鰱、草魚和花鰱魚生產(chǎn)性能的影響

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與養(yǎng)殖

鱸魚、鱖魚采用網(wǎng)箱養(yǎng)殖，全冰鮮飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組按每噸飼料添加零耗氧活性菌1kg，飼養(yǎng)30d，每天抽樣檢查。對(duì)照組飼喂不添加任何添加物的冰鮮飼料。

白鰱、草魚、花鰱采用池塘養(yǎng)殖方式，水深1.2～1.5m，每畝投入魚苗10萬尾，基礎(chǔ)餌料為黃豆?jié){，實(shí)驗(yàn)組按每噸飼料添加“零耗氧活性菌”1kg，飼養(yǎng)25d，每天抽樣檢查。對(duì)照組飼喂不添加任何藥物。

青蝦苗是由南灣水庫(kù)直接捕撈的抱仔青蝦所繁育的蝦苗，放養(yǎng)規(guī)格7000尾/kg，每口池放養(yǎng)數(shù)量約6萬尾，重量為8.6kg。每日喂料2次，基礎(chǔ)飼料為：豆粉、魚粉、皮糠、次粉、貝殼粉、礦物質(zhì)、螺旋藻混合物。實(shí)驗(yàn)組添加抗菌肽，按每噸飼料添加抗菌肽1kg。對(duì)照組飼喂不添加任何添加物的基礎(chǔ)飼料。

1.5 飼養(yǎng)管理

堅(jiān)持每天2次巡池，檢查實(shí)驗(yàn)魚蝦攝食情況，及時(shí)調(diào)整日投餌量，嚴(yán)格檢查排水過濾設(shè)施是否破損，及時(shí)撈出殘餌雜物、多余水草，捕捉蛙、蛇等敵害生物。保證微流水暢通、有充足的氧氣。定期使用生石灰進(jìn)行全池潑灑消毒，生石灰用量為每口池每次7.5 kg。

1.6 生產(chǎn)性能指標(biāo)測(cè)定

每天采集數(shù)據(jù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)成活率、畝平均產(chǎn)量、平均個(gè)體重，計(jì)算餌料報(bào)酬等，并對(duì)發(fā)病率進(jìn)行λ2卡方顯著性分析。

表3 “零耗氧活性菌”對(duì)青蝦生產(chǎn)性能的影響

2 結(jié)果

2.1 “零耗氧活性菌”的最小抑菌濃度

通過微量稀釋法測(cè)得“零耗氧活性菌”對(duì)柱狀屈橈桿菌、溶藻弧菌和溫和氣單胞菌的MIC分別為0.78、3.12和6.25μg/mL。

2.2 鱸魚和鱖魚養(yǎng)殖結(jié)果

飼養(yǎng)30d，“零耗氧活性菌”實(shí)驗(yàn)組魚苗色澤鮮艷，大小均一。鱸魚實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病率為15.1%，對(duì)照組為26.3%，下降了11.2%。鱖魚實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病率為17.6%，對(duì)照組為20.4%，下降了2.8%?？梢姟傲愫难趸钚跃憋@著或極顯著降低鱖魚和鱸魚的發(fā)病率（P〈0.05或P〈0.01）。實(shí)驗(yàn)組鱸魚的日增重比對(duì)照組高0.14g/d，鱖魚的日增重比對(duì)照組高0.17g/d，表現(xiàn)出較好的生產(chǎn)性能（表1）。

2.3 白鰱、草魚和花鰱魚養(yǎng)殖結(jié)果

表2可以看出應(yīng)用“零耗氧活性菌”后，白鰱的成活率由40%提高至48.77%，草魚的成活率由16.8%提高至22.75%，花鰱的成活率由53.5%提高至68.01%。各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較分別提高了21.93%、35.42%和24.12%。λ2卡方分析表明，“零耗氧活性菌”極顯著提高白鰱、草魚和花鰱的成活率（P〈0.01）。草魚和花鰱的餌料系數(shù)分別降低18.7%和22.9%，每畝平均產(chǎn)量也明顯提高18.42%、19.98%、23.23%。

2.4 青蝦養(yǎng)殖結(jié)果

由表3可知，至實(shí)驗(yàn)期結(jié)束，實(shí)驗(yàn)組青蝦平均增長(zhǎng)了2.3cm，對(duì)照組為1.4 cm。實(shí)驗(yàn)組的平均增長(zhǎng)是對(duì)照組的1.64 倍，比對(duì)照組提高了64.29%。實(shí)驗(yàn)組平均產(chǎn)量101 kg/畝，對(duì)照組平均產(chǎn)量58.5 kg/畝，實(shí)驗(yàn)組平均產(chǎn)量是對(duì)照組的1.73 倍，比對(duì)照組提高72.65%。

3 討論

微生態(tài)制劑“零耗氧活性菌”可以使細(xì)菌的細(xì)胞膜去極化或者形成“孔洞”，造成細(xì)胞內(nèi)容物外流或者肽分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與DNA、RNA等形成靶向作用，進(jìn)而殺死細(xì)菌。

體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，“零耗氧活性菌”對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌如柱狀屈橈桿菌、溶藻弧菌和溫和氣單胞菌敏感，最小抑菌菌濃度分別為0.78、3.12和6.25μg/mL。添加到飼料中“零耗氧活性菌”仍具有顯著的抗菌活性，可以顯著提高魚苗的抗病能力。將“零耗氧活性菌”用于魚苗培育階段，平均成活率可以提高10%以上。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，“零耗氧活性菌”也能明顯提高魚、蝦的生長(zhǎng)速度及飼料利用效率，日增重明顯增加，餌料報(bào)酬亦增加。

“零耗氧活性菌” 除具有抗菌、殺菌作用，對(duì)病毒、真菌、寄生蟲等其他病原微生物具有較強(qiáng)的抑制作用，還能與宿主體內(nèi)某些陽離子蛋白、溶菌酶協(xié)同作用，增強(qiáng)其抗菌效應(yīng)。另外，“零耗氧活性菌”生物學(xué)活性穩(wěn)定，在高離子強(qiáng)度和酸、堿環(huán)境中或100℃加熱10min時(shí)仍具有殺菌抑菌作用。實(shí)驗(yàn)用“零耗氧活性菌”可耐高溫（150℃以上），能耐受飼料制粒時(shí)的高溫。同時(shí)，“零耗氧活性菌”是一種無毒、無害、綠色環(huán)保的產(chǎn)品，還具有不易出現(xiàn)耐藥性突變、分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、作用迅速等特點(diǎn)。