胡天俊，何揚子

1.盤州市中醫(yī)院，貴州 六盤水 553500；2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510000

由于經(jīng)濟社會的快速發(fā)展及生活、工作節(jié)奏的日益加快，迫使人們不斷延長工作和學(xué)習(xí)時間，導(dǎo)致睡眠時間縮短，呈現(xiàn)出不同程度的睡眠剝奪(Sleep Deprivation，SD)現(xiàn)象。睡眠剝奪是指剝奪部分或整個睡眠過程后迫使受試對象出現(xiàn)持續(xù)覺醒的狀態(tài)(通常以24 h中睡眠時間不超過4 h來衡量)。研究表明，睡眠剝奪可改變機體情緒、記憶、學(xué)習(xí)及免疫等多種功能；隨著睡眠剝奪的持續(xù)存在，甚至可引起生理、心理及行為的變化，進而帶來更大的危害[1～5]。本研究擬從機體TLR4免疫信號通路及miR146a的表達情況來探討電針改善睡眠剝奪的機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 32只SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，6～8周齡，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2011-0015，生產(chǎn)批號：NO.44002100004077，飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動物實驗管理中心SPF級動物房內(nèi)。按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、安定組和電針組，每組8只，正常隔離飼養(yǎng)7天后進行實驗干預(yù)。實驗條件為室內(nèi)溫度26℃，相對濕度50%，照明周期12 h/12 h，工作照度150～300 Lux，噪聲與震動控制≤60 dB，實驗時間為每天 8：00-17：00。

1.2 藥物與試劑 安定(地西泮)注射液：天津金耀氨基酸有限公司，10 mg/2 mL，批號：1407101。戊巴比妥鈉(Pentobathital Sodium)：北京化學(xué)試劑公司，25 g/瓶，批號：69020100。對氯苯丙氨酸(Para-chlorophenylalanine，PCPA)：日本TCI公司，250 g/瓶，批號：H110130000。

1.3 實驗器材 YP601N型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司，編號380507070012，d=0.1 mg。KWD-808系列(Ⅰ型)脈沖針灸治療儀：常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司。0.22×25 mm無菌針灸針：蘇州市華佗醫(yī)療用品有限公司，批號：150102。

1.4 模型制備與處理方法 對照組常規(guī)飼養(yǎng)，未作任何處理，自由進食、飲水，定期更換墊料；模型組、安定組和電針組在實驗第1、2天按每只45 mg/100 g的劑量每天腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)混懸液制作大鼠睡眠剝奪模型。造模成功后，模型組不再做任何處理。安定組于實驗第3天開始連續(xù)5天，每天腹腔注射安定注射液(給藥劑量：根據(jù)人-鼠給藥劑量體表面積折換率，按成人安定注射液催眠劑量折算出大鼠催眠劑量為0.92 mg/kg)；電針組給予每天電針百會、神庭20 min，連續(xù)5天。取穴與電針操作方法：參照《常用實驗動物針灸穴位圖》，神庭穴位于大鼠頭部額頂骨縫交界線前方，前正中線上；百會穴位于大鼠頭部兩耳連線中點，頂骨正中。電針操作：取1寸無菌針灸針(型號0.22×25 mm)斜刺或平刺神庭、百會穴，進針3～5 mm后連接電針儀，選用連續(xù)波型(電壓6 V，頻率10 Hz)并留針20 min。實驗第8天，各組大鼠在戊巴比妥鈉麻醉下采集脾臟作為實驗樣本。

1.5 指標(biāo)檢測 運用RT-PCR法，將10 mg大鼠脾臟組織置于組織搗碎機中破碎、勻漿提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(總RNA質(zhì)量約1 μg)，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。TLR4、NF-κβ、IRAK1、TRAF6的mRNA檢測采用SYBR Green I熒光法(引物序列見表1)，反應(yīng)總體系為15 μL；miR146a的mRNA檢測采用TaqMan探針法，反應(yīng)總體系為15 μL，此兩法反應(yīng)條件均為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火延伸34 s(40個循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后，將獲得的目的基因mRNA循環(huán)閾值(Cycle threshold，CT)，采用ΔΔCT(ΔΔCT=ΔCT－ΔCT基礎(chǔ)值；ΔCT=CT目的基因－CT內(nèi)參)方法分析，根據(jù)2-△△CT公式計算出相對表達量。

表1RT-PCR的引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用ABI7500 software(Version 2.0.5)和Data Assist3.01軟件對數(shù)據(jù)進行處理，用公式2-△△CT計算基因相對表達量RQ值，將所得結(jié)果運用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料以(±s)表示，進行方差齊性檢驗，采用單因素方差分析(One-Way-ANOVA)表現(xiàn)組間差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脾臟TLR4信號通路關(guān)鍵基因的表達水平比較見表2。與對照組比較，模型組大鼠脾臟TLR4、NF-κβ、IRAK1、TRAF6的mRNA表達量明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，安定組和電針組大鼠脾臟TLR4、NF-κβ、IRAK1、TRAF6的mRNA表達量顯著降低(P＜0.05)，但并未觀察到安定組與電針組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 各組大鼠脾臟miR146a的表達水平比較 見表3。與對照組比較，模型組大鼠脾臟miR146a的表達量升高(P＜0.05)。與模型組比較，安定組大鼠脾臟miR146a的表達量顯著降低，而電針組大鼠脾臟miR146a的表達量卻明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；但并未觀察到安定組與電針組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

表2 各組大鼠脾臟TLR4信號通路關(guān)鍵基因的表達水平比較(±s)

表2 各組大鼠脾臟TLR4信號通路關(guān)鍵基因的表達水平比較(±s)

與對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05

組 別對照組模型組安定組電針組n 8 8 8 8 TLR4 1.00±0.00 1.39±0.16①1.09±0.09②1.08±0.10②N F-κβ 1.00±0.00 1.52±0.19①1.14±0.17②1.05±0.13②IRA K 1 1.00±0.00 1.34±0.17①1.09±0.15②1.06±0.12②TRA F6 1.00±0.00 1.35±0.12①1.08±0.12②1.07±0.11②

表3 各組大鼠脾臟miR146a的表達水平比較(±s)

表3 各組大鼠脾臟miR146a的表達水平比較(±s)

與對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別對照組模型組安定組電針組n 8 8 8 8 miR146a 1.00±0.00 1.20±0.80①1.03±0.44②2.23±0.11②

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，睡眠剝奪可引起神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的失衡，進而影響或破壞正常睡眠過程[6]。有研究表明，睡眠剝奪大鼠體內(nèi)免疫應(yīng)激水平激活，促使白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細(xì)胞因子增多，一定程度上起到調(diào)節(jié)睡眠-覺醒中樞的作用，進而達到改善睡眠及機體免疫水平的目的[7]。

TLR4是TLRs家族中具有代表性的一員，參與了炎性免疫反應(yīng)等多種疾病的發(fā)生。TLR4信號通路中依賴型骨髓樣分化因子88(Myeloiddifferen-tiationfactor88，MyD88)可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-κβ(Nuclear transcription factor κβ，NF-κβ)啟動炎性反應(yīng)中相關(guān)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生和分泌IL-1、IL-6及TNF-α等下游炎性因子，參與機體免疫、睡眠結(jié)構(gòu)和睡眠覺醒行為的調(diào)節(jié)[8]。

miR146是一種多功能基因，不僅具有免疫調(diào)節(jié)功能，而且還參與造血及腫瘤等多種生理病理過程的發(fā)生與發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn)，miR146a可以通過結(jié)合TLR4信號通路中關(guān)鍵蛋白IRAK1和TRAF6的3’UTR區(qū)進而抑制整個信號通路的翻譯過程，導(dǎo)致下游的信號分子不能激活或激活不足，對TLR4信號通路具有負(fù)性調(diào)控作用[10]。

本實驗表明，經(jīng)睡眠剝奪后大鼠體內(nèi)TLR4信號通路激活，隨之TLR4、NF-κβ、IRAK1、TRAF6關(guān)鍵基因表達增多，而經(jīng)過電針治療后睡眠剝奪大鼠體內(nèi)miR146a的表達升高，負(fù)性調(diào)節(jié)TLR4信號通路，使TLR4、NF-κβ、IRAK1、TRAF6基因表達下降，并減少下游炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6和TNF-α的分泌與釋放，最終達到對固有免疫應(yīng)答的調(diào)控作用。此外，本實驗還推測安定注射液對睡眠的調(diào)節(jié)改善作用不是通過升高miR146a的表達來調(diào)控TLR4信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，miR146a對TLR4信號通路的負(fù)性調(diào)控作用復(fù)雜而微妙。通過促進miR146a的表達來調(diào)控炎癥反應(yīng)重要通路之一的TLR4信號通路，對于抑制過度炎癥反應(yīng)具有重大而深遠的意義，但miR146a和TLR4信號通路之間的關(guān)系并非如此簡單，它們之間已形成一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，這一系統(tǒng)對于防止機體過度炎癥反應(yīng)和相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，維持機體正常生理功能起著十分重要的作用，但同時也增加了人類認(rèn)識TLR4信號通路和miR146a相關(guān)疾病的難度。

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