郝萬(wàn)平，王冠，張偉，周之煜，李曉雯

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300050

2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150

3.天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心，天津 300381

創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)是神經(jīng)外科常見(jiàn)疾病，是導(dǎo)致大部分中青年人死亡的主要原因之一，其具有高致殘率、高致死率、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]，使得其急性期的治療尤為重要，其中亞低溫是一種重要治療手段。大量研究證實(shí)，亞低溫(MH)治療可以降低腦代謝，減少腦耗氧量，降低顱內(nèi)壓，改善腦缺血缺氧，通過(guò)提高溫度依賴蛋白冷休克蛋白的含量來(lái)保護(hù)腦組織[2～3]。有一部分國(guó)外文獻(xiàn)表明，亞低溫治療會(huì)增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，易發(fā)肺炎、肺水腫等不良反應(yīng)[4]。因此如何降低亞低溫的不良反應(yīng)是亞低溫更好應(yīng)用于臨床需首要解決的問(wèn)題。有研究表明，中醫(yī)藥的應(yīng)用對(duì)肺水腫的治療有一定的療效[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)在亞低溫治療的同時(shí)加入?yún)⒏椒?，以研究中藥治療?duì)亞低溫治療時(shí)發(fā)生肺水腫的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇清潔級(jí)健康SD大鼠120只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限；動(dòng)物合格證號(hào)：11300223；所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0004，實(shí)驗(yàn)前所有大鼠在25℃和40%濕度下飼養(yǎng)，每天光照16 h。實(shí)驗(yàn)在天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2 藥物與試劑 參附注射液(四川雅安三九藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z51020664)，經(jīng)鼠尾靜脈注射。白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(瑞士Roche公司)、腫瘤壞死因子 -α(TFN-α)ELISA試劑盒(瑞士 Roche公司)。

1.3 模型制備 顱腦損傷模型[6]：將大鼠麻醉并固定于動(dòng)物腦立體定位儀支架上，無(wú)菌條件下矢狀位切開(kāi)頭皮，在右頂骨鉆孔(距顱骨冠狀縫3 mm、矢狀縫右側(cè)3 mm)，開(kāi)直徑約3 mm骨窗，采用動(dòng)物顱腦損傷模型液壓打擊裝置進(jìn)行顱腦損傷模型致傷，致傷打擊力為200 kPa，打擊后縫合頭皮，致傷后即刻開(kāi)始給予亞低溫治療。

1.4 分組及干預(yù) 按隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功大鼠分為以下4組：模型組、亞低溫組、中藥組、亞低溫加中藥組，每組30只。模型組和亞低溫組大鼠尾靜脈注射生理鹽水，中藥組和亞低溫加中藥組大鼠尾靜脈注射參附注射液，劑量按藥物說(shuō)明書給予正常成人每日用藥劑量(1 mL/kg)。亞低溫組和亞低溫加中藥組予以亞低溫治療12 h(亞低溫加中藥組在亞低溫治療后注射參附注射液)，將大鼠置于恒定低溫實(shí)驗(yàn)冰毯上，保持肛溫(31±0.5)℃。4組大鼠均尾靜脈注射，每天1次，連用3天。1.5 觀察各組大鼠出現(xiàn)肺水腫數(shù)量 分別于6 h、12 h、1天、2天、3天觀察4組實(shí)驗(yàn)大鼠呼吸節(jié)律、唇舌黏膜是否發(fā)生改變，雙肺是否出現(xiàn)濕啰音。通過(guò)觀察大鼠是否出現(xiàn)呼吸頻率、節(jié)律變快，出現(xiàn)呼吸困難，唇舌黏膜紫紺，雙肺可聞及干濕啰音等情況判定，并記錄各組大鼠出現(xiàn)肺水腫的數(shù)量。

1.6 標(biāo)本采集及處理 治療3天后，從4組中取出相等數(shù)量發(fā)生肺水腫的大鼠各10只并將其處死，取出大鼠的雙肺，置于液氮中保存。大鼠的左肺用于測(cè)定干濕重比，右肺測(cè)定肺組織中IL-6、TFN-α的含量。

1.7 測(cè)定大鼠肺干濕比 取出大鼠左肺，用吸水紙吸干肺表面水分、血跡等，稱濕重后置于烤箱中60℃，烘烤72 h后稱干重，分別測(cè)定各組大鼠肺濕干比(肺組織濕重/干重)(Wet-weight/Dry-weight，W/D)來(lái)評(píng)估肺水腫程度。

1.8 大鼠肺組織炎性因子的測(cè)定 取出大鼠的右肺，按照ELISA法及說(shuō)明書分別檢測(cè)大鼠肺組織IL-6、TFN-α的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺水腫發(fā)生率比較 見(jiàn)表1。與模型組比較，亞低溫組大鼠肺水腫發(fā)生率顯著較高(P＜0.05)，中藥組與亞低溫加中藥組無(wú)明顯變化(P＞0.05)。與亞低溫組比較，中藥組和亞低溫加中藥組大鼠肺水腫發(fā)生率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠肺水腫發(fā)生率比較

2.2 各組大鼠肺濕干重比（W/D）比較 見(jiàn)表2。與模型組比較，亞低溫組大鼠肺濕重、肺濕干重比顯著升高(P＜0.05)，中藥組、亞低溫加中藥組則無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與亞低溫組比較，中藥組和亞低溫加中藥組大鼠肺濕重顯著降低，肺濕干重比顯著降低，差均異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠肺濕干重比（W/D）比較(±s)

表2 各組大鼠肺濕干重比（W/D）比較(±s)

與模型組比較，①P＜0.05；與亞低溫組比較，②P＜0.05

組 別模型組亞低溫組中藥組亞低溫加中藥組n 10 10 10 10肺濕重(g)9.432±0.280 9.909±0.359①9.432±0.261②9.413±0.242②肺干重(g)1.525±0.115 1.518±0.113 1.510±0.147 1.503±0.147 W/D 6.207±0.307 6.546±0.262①6.286±0.454②6.306±0.479②

2.3 各組大鼠肺組織中炎癥因子含量比較 見(jiàn)表3。與模型組比較，亞低溫組大鼠肺組織中IL-6、TFN-α含量顯著升高(P＜0.05)，中藥組、亞低溫加中藥組大鼠肺組織中IL-6、TFN-α含量無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與亞低溫組比較，中藥組和亞低溫加中藥組大鼠肺組織中IL-6、TFN-α含量顯著降低，差均異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠肺組織中炎癥因子含量比較(±s)

表3 各組大鼠肺組織中炎癥因子含量比較(±s)

與模型組比較，①P＜0.05，與亞低溫組比較，②P＜0.05

組 別模型組亞低溫組中藥組亞低溫加中藥組n 10 10 10 10 IL-6(μg/L)151.04±17.09 172.32±13.85①150.88±23.11②150.98±23.17②TFN-α(pg/mL)168.33±18.01 186.84±14.09①170.73±13.92②169.42±13.98②

3 討論

亞低溫是治療顱腦損傷急性期的重要方法之一，但亞低溫期并發(fā)肺水腫是影響亞低溫治療的主要不良反應(yīng)。肺水腫是指體液在肺間質(zhì)或肺泡內(nèi)積聚而造成肺血管外液量增加的病理狀態(tài)，肺毛細(xì)血管壁通透性增加及毛細(xì)血管內(nèi)壓力增加是其主要原因[7]。亞低溫治療后患者的肺炎、肺水腫發(fā)生率是常規(guī)治療的2倍以上[8]。而且肺水腫作為臨床急危癥之一，同時(shí)會(huì)降低患者的生存率，因此如何降低TBI后MH治療期肺水腫的發(fā)生率是研究的重點(diǎn)內(nèi)容。肺水腫發(fā)生后需要及時(shí)救治，結(jié)合顱腦損傷患者的神經(jīng)功能受到損傷、機(jī)體免疫功能下降等情況，西醫(yī)治療聯(lián)合參附注射液能有效改善神經(jīng)源性肺水腫的程度[9]。

本實(shí)驗(yàn)以亞低溫治療顱腦損傷后出現(xiàn)肺水腫為出發(fā)點(diǎn)，研究參附方對(duì)MH治療后肺水腫的影響。結(jié)果顯示，亞低溫治療后機(jī)體大多是處于神昏，形寒肢冷，面色蒼白，口唇青紫，氣短或促，咯白痰，痰稠，痰鳴漉漉，舌絳紫或胖淡，苔白膩，脈沉細(xì)或弦滑的寒、瘀、閉狀態(tài)。參附方由人參、附子組成，具有溫陽(yáng)益氣、回陽(yáng)救逆等作用，剛好適用于亞低溫治療后的寒凝瘀閉狀態(tài)[10～11]，通過(guò)其溫煦作用，發(fā)揮其對(duì)亞低溫狀態(tài)下發(fā)生肺水腫的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)各組肺水腫發(fā)生數(shù)量、肺水腫發(fā)生率，肺水腫嚴(yán)重程度，及炎癥因子含量的測(cè)定比較可以推測(cè)：⑴亞低溫治療顱腦損傷大鼠后在一定程度上會(huì)增加肺水腫的發(fā)生率及肺水腫的嚴(yán)重程度。其可能的原因有：顱腦損傷后神經(jīng)功能受到嚴(yán)重的損傷，在亞低溫狀態(tài)下，機(jī)體的整體免疫機(jī)制降低，機(jī)體吸入病原菌后易造成肺部感染[12]。同時(shí)有可能在低溫狀態(tài)下，大鼠全身血液循環(huán)較正常體溫慢，減緩了肺內(nèi)組織液的循環(huán)，加重肺部瘀血，導(dǎo)致發(fā)生肺水腫的機(jī)率較高。⑵亞低溫加參附方治療后，大鼠的肺水腫發(fā)生率較亞低溫組降低顯著，其可能的機(jī)制有：從中醫(yī)角度講，亞低溫后肺水腫階段機(jī)體處于陰寒凝滯、肺失宣降狀態(tài)，采用具有溫陽(yáng)益氣、扶正祛邪的參附方有助于改善亞低溫后陰寒內(nèi)侵的狀態(tài)。參附方可能通過(guò)促進(jìn)冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRP)表達(dá)來(lái)降低細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)表達(dá)，抑制繼發(fā)的轉(zhuǎn)錄因子磷酸化啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮其輔助亞低溫治療和抗凋亡作用[13～14]，減少在亞低溫時(shí)受損的中樞神經(jīng)對(duì)肺的影響作用。⑶亞低溫加中藥組與模型組、中藥組之間各項(xiàng)比較無(wú)顯著差異，推測(cè)顱腦損傷后發(fā)生肺水腫的可能機(jī)制有：①血流動(dòng)力學(xué)的改變導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓；②肺毛細(xì)血管滲透機(jī)制導(dǎo)致肺內(nèi)α受體和β受體活性比例失調(diào)造成；③沖擊學(xué)說(shuō)即大腦受到損傷后引起的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，參附方應(yīng)用在TBI后MH治療期，在一定程度上減輕了大鼠肺水腫發(fā)生率及肺水腫嚴(yán)重程度，有可能是參附方通過(guò)自身溫陽(yáng)益氣作用拮抗了亞低溫治療時(shí)機(jī)體陰寒凝滯的狀態(tài)，提高了機(jī)體的免疫力從而減輕MH后增加肺水腫發(fā)生率的副作用，為今后亞低溫的研究提供了思路。在治療上可以中西結(jié)合，發(fā)揮中醫(yī)藥在臨床中的優(yōu)勢(shì)，減少亞低溫的副作用，更好發(fā)揮亞低溫的積極作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確，有待今后的進(jìn)一步研究。

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