李一卉，孫璐，戴程婷，袁慶新(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南京210029)

糖尿病是一類由遺傳、環(huán)境、免疫功能紊亂等因素誘發(fā)的嚴重危害健康的慢性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未完全明確[1]。研究發(fā)現，氧化應激(OS)在糖尿病發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用[2]。內質網是所有分泌型蛋白和膜蛋白折疊、成熟、儲存和轉運的場所。近年研究發(fā)現，內質網應激(ERS)與糖尿病胰島β細胞功能減退和胰島素抵抗密切相關，OS與ERS的相互作用將會加重胰島β細胞的損傷[3～5]。胰島素原是胰島素的前體物質，可裂解為一分子胰島素和一分子C肽[6]。胰島素原能否在內質網中正確折疊、進而成熟為構象未成熟胰島素原復合物(CIPC)，對于胰島素的合成及釋放起重要作用。2016年2月～2017年2月，我們觀察了抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對OS所致胰島素原成熟及胰島β細胞分泌胰島素功能的影響，探討減輕OS對改善胰島β細胞功能的作用及機制，為預防糖尿病的發(fā)生和發(fā)展提供新方向。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料 小鼠胰島細胞系MIN6細胞來源于南京醫(yī)科大學生物化學系德偉教授實驗室。高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含有15 %胎牛血清、50 μmol/L β-巰基乙醇、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)、胎牛血清、雙抗(Gibco公司，美國)；β-巰基乙醇、臺盼藍、過氧化氫(H2O2，Sigma公司，美國)；2′7′-二氯熒光素-乙酰乙酸酯(H2DCFDA，Invitrogen公司，美國)；胰島素原單克隆抗體、胰島素多克隆抗體、管蛋白(Tubulin)多克隆抗體(Abcam公司，英國)；胰島素放免試劑盒(北京北方生物科技研究所，中國)。

1.2 細胞培養(yǎng) MIN6細胞在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞貼壁生長，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每天換液。待細胞密度達75%以上時，按1∶2傳代。

1.3 H2O2最佳干預劑量的確定 培養(yǎng)MIN6細胞，生長到對數生長期時，胰酶消化，PBS清洗；終止消化后，加培養(yǎng)基吹勻，然后取等量細胞液種植在6孔板中；待細胞密度達75%左右時，選取不同濃度(0、11 nmol/L、22 nmol/L、44 nmol/L、88 nmol/L及10 μmol/L)H2O2加入培養(yǎng)基，測定不同H2O2濃度時細胞死亡率及蛋白中CIPC含量；發(fā)現當H2O2濃度為10 μmol/L時，CIPC含量明顯增加，且細胞保持較低的死亡率，從而確定10 μmol/L H2O2作為OS干預的最佳劑量。

1.4 細胞分組及干預方法 分為對照組、H2O2處理組、H2O2+NAC處理組。對照組在培養(yǎng)基中不加入H2O2及NAC處理；H2O2處理組在培養(yǎng)基中加入10 μmol/L H2O2處理；H2O2+NAC處理組培養(yǎng)基中加入10 μmol/L H2O2刺激4 h后，再加入250 μmol/L NAC處理。各組細胞再次放入37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。

1.5 細胞死亡率檢測 采用臺盼藍染色法。各組細胞放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。向各組培養(yǎng)皿中加入臺盼藍試劑，于顯微鏡下觀察細胞生存狀態(tài)、形態(tài)；并對死亡及生存細胞進行手動計數，計算細胞死亡率。

1.6 細胞中活性氧簇(ROS)表達水平檢測 采用H2DCFDA熒光探針法。取各組細胞，胰蛋白酶消化，收集細胞；用PBS洗滌后，加入H2DCFDA，放在37 ℃孵育30 min。PBS洗滌3次，熒光酶標儀檢測熒光強度，熒光強度越強代表ROS表達水平越高。

1.7 MIN6細胞胰島素原、CIPC蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，提取細胞總蛋白；運用非還原Tris-tricine-urea-SDS-PAGE膠進行電泳[7]，采用Western blotting法檢測細胞中胰島素原、CIPC蛋白表達。以Tubulin作為內參。計算胰島素原/CIPC比例。

1.8 細胞上清胰島素相對含量檢測 采用放免法(RIA)。取各組細胞上清，4 ℃ 700 r/min離心10 min，取離心后上清150 μL。采用RIA法檢測胰島素，所用儀器型號為DFM-96型16管手動放射免疫γ計數器，計算各組細胞上清胰島素相對含量。

2 結果

2.1 各組細胞死亡率比較 H2O2處理組細胞死亡率高于對照組，H2O2+NAC處理組細胞死亡率低于H2O2處理組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細胞ROS表達水平比較 H2O2處理組細胞ROS表達水平高于對照組，H2O2+NAC處理組細胞ROS表達水平低于H2O2處理組(P均<0.05)。見表1。

2.3 各組細胞胰島素原/CIPC比較 H2O2處理組細胞胰島素原/CIPC低于對照組，H2O2+NAC處理組細胞胰島素原/CIPC高于H2O2處理組(P均<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組細胞胰島素原、CIPC表達情況(Western blotting法)

2.4 各組細胞上清胰島素相對含量比較 H2O2處理組細胞上清胰島素相對含量低于對照組，H2O2+NAC處理組細胞上清胰島素相對含量高于H2O2處理組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞檢測指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與H2O2處理組比較，△P<0.05。

3 討論

糖尿病臨床診斷明確時，胰島β細胞的功能已經損傷明顯。如何在糖尿病早期進行有效的干預，是保護胰島β細胞功能、延緩和預防胰島β細胞凋亡的重要方法。胰島素的正確合成是維持血胰島素水平的基礎，首先是編碼胰島素的基因經過轉錄、翻譯，形成前胰島素原；然后前胰島素原在內質網剪切信號肽，形成胰島素原；胰島素原再移位到高爾基體，剪切成胰島素和C肽儲存在細胞質的囊泡中，最后釋放入血[8,9]。近來有學者認為，胰島素原向胰島素的轉換異常，即正確折疊的胰島素原減少、CIPC大量堆積，是糖尿病發(fā)生的重要原因[10]。

胰島β細胞具有高度發(fā)達的內質網，這與其需要合成和分泌大量的胰島素及多種糖蛋白相適應，也容易受到各種應激的損傷。其中，OS作為糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要原因，已被廣大學者認可[2]。由于體內氧化與抗氧化作用失衡，從而導致中性粒細胞炎性浸潤、蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物，這是ROS在體內產生的一種負面作用[11]。內質網的氧化環(huán)境對于蛋白質的合成及分泌亦至關重要[12]，它參與二硫鍵的形成、蛋白質的折疊和裝配、糖基化、聚糖作用，還是Ca2+貯存的重要場所[6]，分泌蛋白的正確折疊對是維持其功能正常的首要條件。未折疊或錯誤折疊的蛋白不能正常分泌，在細胞堆積時，即通過泛素/蛋白酶體系統(tǒng)、溶酶體系統(tǒng)或通過自噬的方式被降解、清除。胰島素原在內質網進行合成的過程中，若發(fā)生錯誤折疊，可導致CIPC的產生。一方面，CIPC不能進行下一步剪切，從而使胰島素合成減少，引起血糖升高。另一方面，胰島素原因轉換為CIPC無法輸出而堆積，不僅會引起ERS，還可能使內質網腔的Ca2+滲出；細胞質Ca2+濃度的升高刺激線粒體產生更多的活性ROS，誘發(fā)或加重OS[6]，OS與ERS的相互作用、惡性循環(huán)可能加重β細胞的損傷[5]。所以，蛋白質錯誤折疊和ROS的產生是緊密相關的事件，但聯系二者的機制尚不明確。胰島素原錯誤折疊及成熟障礙很可能是OS及ERS引起糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要原因[13,14]。本研究發(fā)現，H2O2處理組與對照組相比，細胞死亡率升高、ROS表達水平升高、胰島素原/CIPC降低、上清胰島素含量相對減少。這表明OS加重了胰島素原的錯誤折疊并堆積，并可導致胰島β細胞出現OS損傷、死亡及胰島素分泌功能障礙。因此，如何減輕OS損傷，從而減少胰島素原的錯誤折疊、促進胰島素原的成熟，可能是保護胰島β細胞功能、預防糖尿病進展的有效方法。

研究發(fā)現，抗氧化劑可以減輕糖尿病癥狀及血糖水平[15,16]。NAC是含巰基的抗氧化劑，是體內合成谷胱甘肽的原料，能清除體內的ROS，保護許多蛋白質和酶等分子中的巰基不被氧化，但其降糖機制尚不明確。本研究顯示，H2O2+NAC處理組較H2O2處理組細胞死亡率降低、ROS表達水平降低、胰島素原/CIPC升高、上清胰島素相對含量增加。這提示NAC可以改善H2O2導致的胰島β細胞損傷，還可以改善OS引起的胰島素原成熟障礙及胰島素的釋放異常，有效地保護胰島β細胞功能。

綜上所述，NAC可以改善H2O2導致的胰島β細胞損傷，改善OS引起的胰島素原成熟障礙及胰島素的釋放異常，有效保護胰島β細胞功能。因此，胰島素原成熟障礙、降解增多及相關的ERS和OS可能是糖尿病早期干預的重要靶點。但是，ERS是泛在的保護機制，ERS和OS關系究竟如何，以及抗氧化劑改變OS的具體機制尚待深入研究。

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