黃洋峰，蔣薇

(四川省人民醫(yī)院，成都 610000)

急性胰腺炎(AP)是由胰腺酶被激活而造成的胰腺及其周?chē)M織自我消化的急性炎癥[1]，膽道疾病、過(guò)量乙醇攝入、十二指腸液反流、高脂血癥等均可導(dǎo)致AP發(fā)生，是常見(jiàn)急腹癥。AP可分為急性水腫型胰腺炎和急性出血壞死型胰腺炎(ANP)。磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/磷酸化核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)信號(hào)通路廣泛存在于生物體內(nèi)，可影響細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡以及蛋白質(zhì)合成等，與臨床多種疾病有關(guān)[2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)p-mTOR/p70S6K信號(hào)通路在ANP發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制研究較少，2016年2月～2017年6月，本文以大鼠ANP動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，通過(guò)雷帕霉素藥物干擾，觀察p-mTOR/p70S6K的生物學(xué)功能變化，探求ANP與p-mTOR/p70S6K信號(hào)通路之間的關(guān)系，尋找ANP的有效治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，6周齡，96只。許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030，動(dòng)物和試驗(yàn)場(chǎng)地由成都里來(lái)生物科技有限公司提供。藥物：?；悄懰徕c(成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，CAS號(hào)：145-42-6);雷帕霉素(成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，CAS號(hào)：53123-88-9)。主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器:ELISA試劑盒：腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司，TUNEL試劑盒(In situ cell death detection kit-POD法，10279600)購(gòu)自瑞士Roche公司，mTOR和p70S6K蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。多聚甲醛(AR級(jí))、伊紅液(AR級(jí))、蘇木素(AR級(jí))均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；全自動(dòng)生化分析儀(日本Sysmex)，Multlskan酶標(biāo)儀(賽默飛世爾)，C2500低溫離心機(jī)(湖南湘儀)，轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)徠卡)，BMJ-Ⅲ型-099包埋機(jī)(中威電子)，PHY-Ⅲ型-U22病理組織漂烘儀(中威電子)。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組 應(yīng)用Excel的隨機(jī)函數(shù)RAND將96只大鼠隨機(jī)分為3組，分別為空白對(duì)照組、ANP模型組和雷帕霉素組，每組32只。ANP模型組，以0.1 mL/min的速度向胰膽管逆行注射1 mL/kg的5%牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)建立大鼠ANP模型[3]；雷帕霉素組，以0.1 mL/min的速度向胰膽管逆行注射1 mL/kg的5%牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)制備大鼠ANP模型后，予0.5 mg/kg雷帕霉素腹腔注射；空白對(duì)照組開(kāi)腹后，翻動(dòng)十二指腸及胰腺3次，關(guān)腹。

1.3 大鼠血清淀粉酶(AMY)及TNF-α、IL-6和IL-10水平的檢測(cè) 于造模后3、6、12、24 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組分別取大鼠8只，麻醉后，迅速?gòu)男呐K采血，靜置60 min，置于4 ℃低溫離心機(jī)，以4 000 r/min、離心15 min，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清AMY水平；按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)不同時(shí)間大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.4 胰腺組織p70S6K和p-mTOR蛋白的檢測(cè) 將上述采血完畢的大鼠，解剖后，取每只大鼠的胰腺組織。于造模后3、6、12、24 h,采用Western blotting法檢測(cè)各組大鼠胰腺組織中p70S6K和p-mTOR蛋白表達(dá)水平。用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，結(jié)果以目的蛋白相對(duì)表達(dá)量表示。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值(IOD)。

1.5 組織病理學(xué)的觀察 將已固定的造模后24 h的大鼠胰腺組織，經(jīng)乙醇梯度脫水后，再透明、石蠟包埋、切片，HE染色后，光鏡(400倍)下觀察組織病變。同時(shí)制備保存未經(jīng)HE染色的石蠟切片，用于后續(xù)TUNEL檢測(cè)。

1.6 胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的檢測(cè) 采用TUNEL法。取“1.5”中制備好的待用石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化后，按照TUNEL試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)胰腺細(xì)胞凋亡情況。每個(gè)標(biāo)本切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡(×200)視野，計(jì)算出細(xì)胞AI，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，取平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間血清AMY及血清炎癥因子水平比較 與ANP模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)雷帕霉素組大鼠血清AMY水平低(P均<0.05)；血清TNF-α水平除了在造模后12 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余時(shí)間點(diǎn)均低(P均<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)血清IL-6均低(P均<0.05)；大鼠血清IL-10高(P<0.01)。空白對(duì)照組與雷帕霉素組不同時(shí)間比較，P均<0.05。見(jiàn)表1。

2.2 胰腺組織p70S6K與p-mTOR蛋白表達(dá)比較 不同時(shí)間點(diǎn)，各組大鼠胰腺組織p70S6K與p-mTOR蛋白的表達(dá)情況見(jiàn)表2。不同時(shí)間點(diǎn)，均可觀察到大小約為70 kD的p70S6K蛋白條帶和大小約為289 kD的p-mTOR蛋白條帶。ANP模型組的p70S6K與p-mTOR蛋白表達(dá)均高于空白對(duì)照組(P均<0.01)，雷帕霉素組該兩種蛋白表達(dá)均低于ANP模型組(P均<0.01)，但仍高于空白對(duì)照組(P均<0.05)。

表1 各組不同時(shí)間血清AMY及炎癥因子水平比較

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠胰腺組織中p70S6K與p-mTOR蛋白表達(dá)比較

2.3 胰腺組織病理變化 空白對(duì)照組胰腺組織無(wú)壞死性改變；ANP模型組胰腺組織呈出血性壞死改變，胰腺間質(zhì)有明顯水腫，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)斑片狀出血灶；雷帕霉素組胰腺組織呈水腫性改變，胰腺間質(zhì)輕微水腫，少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)出血灶，雷帕霉素組胰腺組織病變程度較輕。

2.4 各組胰腺細(xì)胞AI比較 造模后24 h，空白對(duì)照組、ANP模型組、雷帕霉素組AI分別為1.04±0.43、13.91±1.76、7.19±1.57。與空白對(duì)照組比較，ANP模型組、雷帕霉素組AI均高；與ANP模型組比較，雷帕霉素組低(P均<0.01)。

3 討論

ANP是一種常見(jiàn)的急腹癥，伴隨全身性的炎癥反應(yīng)。在這個(gè)炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，會(huì)激活大量胰酶，如胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等[4]。當(dāng)這些胰酶大量釋放后，會(huì)產(chǎn)生自身消化作用，傷及胰腺和胰腺旁組織，甚至導(dǎo)致組織壞死。組織壞死后，機(jī)體進(jìn)一步釋放大量甚至過(guò)量的炎性介質(zhì)，從而引起全身劇烈的炎性反應(yīng)，因此胰酶自身消化以及先后激化的炎性反應(yīng)也是ANP的病理基礎(chǔ)。

AMY可由胰腺泡細(xì)胞分泌，一般存在于胰腺泡細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)胰腺組織遭受致病因子侵襲，這些酶會(huì)大量釋放。臨床上的AP患者大多伴有血清AMY升高，AMY水平也常作為AP診斷及病情評(píng)估的重要指標(biāo)之一[5]。本實(shí)驗(yàn)中，AMY檢測(cè)結(jié)果表明，造模后ANP模型組大鼠血清AMY水平一直持續(xù)升高，經(jīng)雷帕霉素干預(yù)后，盡管AMY在24 h內(nèi)，依然呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢(shì)，但與ANP模型組比較，從造模后6 h開(kāi)始，大鼠血清中AMY水平降低。

TNF-α和IL-6都屬于促炎性細(xì)胞因子。TNF-α能集聚并直接調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞，使全身的代謝和各種類(lèi)型的細(xì)胞免疫反應(yīng)紊亂，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞分裂、分化的正常進(jìn)行[6]。IL-6主要由單核/巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等分泌，是一種急性反應(yīng)性蛋白，能誘導(dǎo)急性期炎性反應(yīng)的產(chǎn)生，促進(jìn)并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞的分裂、分化[7]。在發(fā)生急性炎癥時(shí)，TNF-α和IL-6水平均會(huì)升高。血清TNF-α和IL-6檢測(cè)結(jié)果表明，ANP模型組和雷帕霉素組大鼠血清TNF-α和IL-6水平均在12 h內(nèi)連續(xù)升高，直至第24 h開(kāi)始出現(xiàn)下降。但經(jīng)雷帕霉素干預(yù)后，大鼠血清TNF-α水平除了在造模后12 h，其余時(shí)間點(diǎn)，雷帕霉素組TNF-α水平均低于ANP模型組；大鼠血清IL-6水平從造模后3 h開(kāi)始，直至造模后24 h，雷帕霉素組均低于ANP模型組。血清IL-10具有多效性和兩面性，既能免疫促進(jìn)，也能免疫抑制。其促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在能促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化；抑制作用主要體現(xiàn)在對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的抑制[8]。對(duì)巨噬細(xì)胞，IL-10可以抑制其致炎性細(xì)胞因子的釋放，抑制活性氧中間體的產(chǎn)生；對(duì)于單核巨噬細(xì)胞，可抑制相關(guān)的NK細(xì)胞，抑制IFN-γ和TNF-α合成，這些炎性介質(zhì)的釋放量，也反映了炎癥嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)中，ANP模型組大鼠血清IL-10水平呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢(shì)，造模后6 h達(dá)到峰值，此后逐漸降低，而雷帕霉素組大鼠血清IL-10從造模后3 h開(kāi)始，直至末次檢測(cè)的24 h，一直持續(xù)升高。與ANP模型組比較，從造模后3 h檢測(cè)開(kāi)始，直至24 h，雷帕霉素組IL-10水平均高于ANP模型組。推測(cè)當(dāng)IL-10大量釋放時(shí)，抑制了單核/巨噬細(xì)胞對(duì)TNF-α和IL-6的合成，TNF-α和IL-6的水平均降低，從而減輕了炎癥反應(yīng)。組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，ANP模型大鼠經(jīng)雷帕霉素干預(yù)后，胰腺組織病變程度減輕，癥狀得以改善。

mTOR屬于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)家族成員，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR可調(diào)控細(xì)胞凋亡、參與核糖體合成、蛋白質(zhì)翻譯等細(xì)胞功能。p-mTOR是mTOR的磷酸化狀態(tài)，其水平高低反映了mTOR活化狀態(tài)，是mTOR信號(hào)通路被激活的重要生物學(xué)標(biāo)志。p70S6K是核糖體40s小亞基S6蛋白激酶，在mTOR信號(hào)通路中，p70S6K是一個(gè)重要的分子，協(xié)調(diào)控制細(xì)胞增殖與分化，p70S6K可被p-mTOR激活，進(jìn)而啟動(dòng)翻譯過(guò)程從而控制細(xì)胞的多種病理生理過(guò)程。研究報(bào)道，p-mTOR/p70S6K與乳腺癌、血管瘤、消化系統(tǒng)腫瘤等密切相關(guān)[9]，但與ANP的相關(guān)性報(bào)道較少。本研究中，從造模后3、6、12、24 h的各組大鼠胰腺組織中均檢測(cè)到了p70S6K與p-mTOR蛋白表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量大小分別為70、289 kD。表明大鼠在患ANP時(shí)，mTOR被激活。當(dāng)ANP大鼠經(jīng)雷帕霉素干預(yù)后，雷帕霉素組的p-mTOR和p70S6K蛋白表達(dá)均低于ANP模型組。mTOR包括mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)[10]。mTORC1由mTOR、mLST8及raptor組成，能感受生長(zhǎng)因子、能量狀態(tài)、氨基酸信號(hào)、氧濃度等，以此調(diào)節(jié)某些與細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)的過(guò)程，而mTORC2由mTOR、mLST8及rictor組成，能被生長(zhǎng)因子激活以調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、代謝及細(xì)胞骨架形成[11]。在ANP的病程中，當(dāng)炎性介質(zhì)大量釋放導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇時(shí)，胰腺局部受到的炎癥刺激或者缺氧時(shí)，PI3K/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號(hào)通路被激活，mTORC2可激活A(yù)kt，Akt又影響mTORC1活性部分，共同發(fā)揮生物學(xué)功能[12]。mTOR磷酸化后，可進(jìn)一步激活其下游分子p70S6K，啟動(dòng)p70S6K的磷酸化狀態(tài)。p70S6K的激活，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和分化，而增殖分化出的細(xì)胞繼續(xù)被炎癥因子侵蝕，釋放出更多炎性因子，形成一個(gè)惡性循環(huán)[13]。該循環(huán)內(nèi)，mTOR信號(hào)通路為關(guān)鍵。本研究采用TUNEL法檢測(cè)了胰腺細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明，雷帕霉素組大鼠胰腺細(xì)胞AI與ANP模型組相比降低。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)炎性因子水平變化、p70S6K和p-mTOR蛋白表達(dá)結(jié)果以及細(xì)胞凋亡結(jié)果，推測(cè)其調(diào)控機(jī)制可能是因雷帕霉素能特異性地結(jié)合mTOR，從而抑制mTORC1的活性，并調(diào)節(jié)其下游活性分子p70S6K的水平，降低通路活性，抑制胰腺細(xì)胞增殖分化，抑制了炎癥反應(yīng)，減少了炎癥因子的釋放，有效減輕胰腺組織病變程度。

參考文獻(xiàn)：

[1] 侯斐,劉瑞霞,陰赪宏.炎癥介質(zhì)在急性胰腺炎微循環(huán)障礙中的作用[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015，14(16):1399-1401.

[2] 陳洪菊,屈藝,母得志.mTOR信號(hào)通路的生物學(xué)功能[J].生命的化學(xué),2010,30(4):555-561.

[3] 劉大晟,吳先林,李接興,等.三種不同造模方法建立大鼠急性胰腺炎模型的對(duì)比[J].中國(guó)老年學(xué),2016,36(10):2315-2318.

[4] Zhang H, Pan D, Zhu LM, et al. CaM and TNF-α mediate myocardial damage in acute necrotizing pancreatitis in rats[J]. World Chin J Digesto, 2015,23(26):4162-4166.

[5] 賀晉軍.CT聯(lián)合血清AMY、LPS水平檢測(cè)對(duì)急性胰腺炎的診斷價(jià)值[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊,2018,45(1):57-60.

[6] 彭生,張焰,劉功儉,等.利多卡因?qū)δ[瘤壞死因子α誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)組織工程研究,2009,13(6):1191-1195.

[7] Hunter CA, Jones SA. IL-6 as a keystone cytokine in health and disease[J]. Nat Immunol, 2015,16(5):448.

[8] Oft M. IL-10: master switch from tumor-promoting inflammation to antitumor immunity[J]. Cancer Immunol Re, 2014,2(3):194.

[9] Li PD, Zhang WJ, Zhang MY, et al. Overexpression of RPS6KB1 predicts worse prognosis in primary HCC patients[J]. Med Oncol, 2012,29(5):3070-3076.

[10] Kim YC, Guan KL. mTOR: a pharmacologic target for autophagy regulation[J]. J Clin Invest, 2015,125(1):25.

[11] Kakumoto K, Ikeda J, Okada M, et al. mLST8 promotes mTOR-mediated tumor progression[J]. PLoS One, 2015,10(4):1-15.

[12] Mabuchi S, Kuroda H, Takahashi R, et al. The PI3K/AKT/mTOR pathway as a therapeutic target in ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol, 2015,137(1):173-179.

[13] Chiu LY, Hu ME, Yang TY, et al. Immunomodulatory protein from ganoderma microsporum induces pro-death autophagy through akt-mtor-p70s6k pathway inhibition in multidrug resistant lung cancer cells[J]. PLoS One, 2015,10(5):1-23.