董靜，楊振邦，劉沖，劉睿，張雪梅，張志

(1華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院，河北唐山063000；2華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

模式識(shí)別受體是進(jìn)化保守的機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)感受器，通過識(shí)別外源致病物(病原體相關(guān)分子模式)和內(nèi)源致病物(損傷相關(guān)分子模式)激活胞內(nèi)特異的信號(hào)途徑，進(jìn)而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。目前發(fā)現(xiàn)有5個(gè)模式識(shí)別受體家族，包括Toll受體、核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體(NOD)、AIM受體、GIG-1受體(RLRs)和C型凝集素受體。若模式識(shí)別受體信號(hào)失調(diào)，會(huì)導(dǎo)致感染、炎癥和腫瘤發(fā)生[1]。NOD1是NLRs家族的重要一員，廣泛表達(dá)于胚胎和成體的多種組織細(xì)胞中[2]，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜[3]。NOD1天然識(shí)別一種稱為GM-TriDAP(GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP)的肽聚糖結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)存在于絕大多數(shù)革蘭陰性菌和部分革蘭陽性菌的胞壁中，其中，iE-DAP(γ-D-Glu-mesoDAP)是NOD1的最小活性配體[4]。除了直接結(jié)合細(xì)菌病原體(外源致病物)外，NOD1受體還可感知Rho GTPases活性改變[5]、細(xì)胞骨架組裝異常[3]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]和病毒寄生蟲入侵[7](均為內(nèi)源致病物)，從而啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答，并與惡性腫瘤[8]的發(fā)生密切相關(guān)。

肺癌是目前嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤[9]。目前認(rèn)為,肺結(jié)核、肺炎、哮喘和慢性阻塞性肺疾病等炎性肺部疾病可能是肺癌發(fā)生發(fā)展的誘因[10]，提示模式識(shí)別受體基因多態(tài)性可能賦予個(gè)體對(duì)環(huán)境不同的敏感度，進(jìn)而影響罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，NOD1基因多態(tài)性可影響多種腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[11,12]，但關(guān)于NOD1基因多態(tài)性與肺癌易感性之間的關(guān)系少見報(bào)道。本研究旨在探討NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異與肺癌發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年3月～2012年12月在唐山市工人醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診的原發(fā)性肺癌患者706例(病例組)，男471例、女235例，年齡平均59.26歲，腺癌404例(57.2%)、鱗狀細(xì)胞癌273例(38.7%)，其他類型29例(4.10%)(腺鱗癌15例，支氣管肺泡癌9例和大細(xì)胞肺癌5例)，吸煙者316例(44.8%)，吸煙量平均22.36支/d，非吸煙者390例(55.2%)；選擇同一時(shí)期該院的體檢健康者706例作為對(duì)照組，男474例、女232例，年齡平均59.05歲。吸煙者200例(28.3%)，吸煙量平均25.64支/d，非吸煙者506例(71.7%)。既往無腫瘤史。病例組與對(duì)照組性別、年齡分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例組較對(duì)照組有更多的吸煙者(P<0.01)。用查閱病歷資料結(jié)合問卷調(diào)查方式收集研究對(duì)象一般人口學(xué)資料及臨床病理資料，并獲得知情同意。本研究獲得華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異的基因分型 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RLFP)法。DNA提取：收集研究對(duì)象的外周靜脈血2 mL，采用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取試劑盒提取DNA。NOD1 rs2075819上游引物：5′-GCAACTCGCAGATGCCTAC-3′，下游引物：5′-CATTCCCATACTTCCAAAG-3′。NOD1 rs2075820上游引物：5′-CACGGGCCGGCTAGACGCAGGGGT-3′，下游引物：5′-AGGCGCGCAGGTGGCTGGGGGAGA-3′。PCR反應(yīng)體系為11 L，含上下游引物各0.3 L(10 mmol/L)，基因組DNA 1～100 ng，2×PCR mix(2×Es Taq MasterMix，康為世紀(jì)生物科技公司)6 L，加水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、3 min，94 ℃、40 s，56 ℃、1 min(rs2075819)/65 ℃、1 min(rs2075820)，72 ℃、30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃、3 min。酶切反應(yīng)體系為10 L，含PCR產(chǎn)物6 L，10×CutSmart Buffer(NEB公司)1 L，F(xiàn)BS(Gibco公司)0.1 L，限制性內(nèi)切酶BsmFⅠ(rs2075819，NEB公司)0.1 L/BseRⅠ(rs2075820，NEB公司)0.25 L，加水補(bǔ)足。酶切條件為65 ℃水浴2 h(rs2075819)/37 ℃水浴3 h(rs2075820)。酶切產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型判斷和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻次或百分比表示,比較采用χ2檢驗(yàn);用Logistic回歸分析評(píng)價(jià)NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A變異與肺癌遺傳易感性之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型判讀 NOD1 rs2075819A>G酶切后三種基因型：AA基因型產(chǎn)生一個(gè)338 bp的片段；AG基因型產(chǎn)生338 bp、247 bp和91 bp三個(gè)片段；GG基因型產(chǎn)生247 bp和91 bp兩個(gè)片段。NOD1 rs2075820 G>A酶切后三種基因型：AA基因型產(chǎn)生一個(gè)419 bp片段；GA基因型產(chǎn)生419 bp、267 bp和152 bp三個(gè)片段；GG基因型產(chǎn)生267 bp和152 bp兩個(gè)片段。每個(gè)檢測(cè)單元均設(shè)立陰性對(duì)照及兩個(gè)以上隨機(jī)重復(fù)樣本進(jìn)行質(zhì)量控制，并于總樣本中隨機(jī)抽取30個(gè)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2.2 NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 Logistic回歸分析表明，與NOD1 rs2075819AA基因型攜帶者相比，rs2075819AG基因型攜帶者發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99,P<0.05)。而NOD1 rs2075820各基因型在兩組的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異對(duì)肺癌發(fā)病影響的分層分析 年齡分層顯示，在≤60歲組中，rs2075819 AG基因型攜帶者具有較低的肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.69，95%CI=0.51～0.94，P=0.018)，而在>60歲組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。吸煙分層顯示，在不吸煙者中，rs2075819 AG基因型攜帶者具有較低的肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.74，95%CI=0.56～0.98，P=0.037)。見表1。rs2075820G>A遺傳變異在年齡和吸煙分層中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 NOD1 rs2075819A>G遺傳變異與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系分層研究

表2 NOD1 rs2075820G>A遺傳變異與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系分層研究

3 討論

NOD1基因位于人染色體7p14-15，編碼953aa，蛋白由3段結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：C端亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域，直接識(shí)別外源致病物和內(nèi)源致病物[13]；中央核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域，具有天然ATP酶活性，負(fù)責(zé)與配體結(jié)合后發(fā)生自身寡聚化，從而招募下游信號(hào)蛋白[14]；N端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)，與適配蛋白R(shí)IP2通過同型CARD-CARD相互作用激活神經(jīng)生長(zhǎng)因子κB、絲裂原激活的蛋白激酶和干擾素刺激基因因子3等信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1[15,16]，進(jìn)而啟動(dòng)免疫應(yīng)答，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。通過分析癌癥基因數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)信息，我們發(fā)現(xiàn)，NOD1在肺腺癌和肺鱗癌中均呈現(xiàn)顯著性低表達(dá)，盡管有研究顯示乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)的NOD1可能通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的形式而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[8]，但這種失調(diào)對(duì)于肺癌發(fā)生發(fā)展的影響機(jī)制尚不明確，也可能是弱化機(jī)體免疫對(duì)肺癌細(xì)胞的監(jiān)控，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生存和發(fā)展[17]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，NOD1基因rs2075819A>G變異影響中國(guó)北方人群非小細(xì)胞肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與NOD1rs2075819AA基因型攜帶者相比，rs2075819AG基因型攜帶者具有較低的肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。通過年齡分層分析，我們發(fā)現(xiàn)在≤60歲者中，rs2075819AG基因型攜帶者具有較低的肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而在>60歲者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這個(gè)結(jié)果同M?ckelmann等[11]在德國(guó)人群中對(duì)結(jié)直腸癌的研究結(jié)果一致，顯示僅在<50歲組中，rs2075819A>G會(huì)降低結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。NOD1 rs2075819位于NOD1基因第5號(hào)內(nèi)含子中，該位點(diǎn)多態(tài)性的功能意義不十分清楚，可能位于剪接元件中影響轉(zhuǎn)錄本的剪接效率。此外，我們同時(shí)對(duì)NOD1 rs2075820G>A對(duì)非小細(xì)胞肺癌遺傳易感性的影響進(jìn)行了研究，未發(fā)現(xiàn)具有相關(guān)性。這與M?ckelmann等[11]的研究結(jié)果不一致，提示NOD1 rs2075820遺傳變異可能在不同人種、不同組織中具有不同的作用機(jī)制。NOD1 rs2075820G>A(也稱NOD1 E266K)位于NOD1基因第6號(hào)外顯子中，G>A變異使編碼谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?，?dǎo)致氨基酸性質(zhì)發(fā)生改變，但關(guān)于這種變異如何影響NOD1基因功能未有報(bào)道。

吸煙是導(dǎo)致肺癌發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境因素。本研究病例組中44.8%的患者為吸煙者，而對(duì)照組中僅有28.3%為吸煙者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了吸煙因素增加肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。有研究顯示吸煙會(huì)直接影響NOD1信號(hào)通路[18]，我們進(jìn)一步對(duì)NOD1 rs2075819A>G和NOD1 rs2075820G>A進(jìn)行吸煙分層分析，結(jié)果顯示rs2075819A>G遺傳變異與肺癌易感性相關(guān)只發(fā)生在不吸煙者中。

本研究同Ozbayer等[12]的研究均表明NOD1基因多態(tài)性與肺癌發(fā)病相關(guān)，證實(shí)了先天性免疫受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，提示包括NOD1受體在內(nèi)的先天性免疫受體作為肺癌治療靶點(diǎn)的潛能。然而，本研究對(duì)NOD1多態(tài)位點(diǎn)的功能學(xué)機(jī)制未做深入研究，同時(shí)所研究的多態(tài)位點(diǎn)較少，因此還需要更多的多態(tài)位點(diǎn)在更大的樣本量中進(jìn)一步研究。

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