陳學生，楊秀梅，曹 健

（甘肅省酒泉市畜牧獸醫(yī)局，酒泉 735000）

細胞凋亡，也稱細胞程序性死亡，是一種受遺傳學機制調(diào)控的為維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細胞主動性死亡過程，為多細胞生物生命活動所必需［1］。Fas抗原，也稱CD95、APO-1或TNFRSF6，是一種Ⅰ型膜蛋白，其分子大小為45 kDa，屬于腫瘤壞死因子（TNF）/神經(jīng)生長因子受體家族［2］，F(xiàn)as系統(tǒng)功能正常對機體自身穩(wěn)定具有重要作用，其功能過強或缺陷均可導(dǎo)致發(fā)生疾?。?］。FasL是Fas的配體（Fas是FasL的受體），主要在被激活的T細胞和B細胞上表達。當Fas抗原和FasL結(jié)合后，可以誘發(fā)Fas表達，引發(fā)細胞凋亡［4］。Fas基因分別位于小鼠的19號和人的10號染色體上，包含9個外顯子［5-6］。Fas廣泛表達于各種正常的組織和細胞，如活化的T細胞和 B 細胞［7］。

牦牛是我國青藏高原及其周邊高寒牧區(qū)重要的生產(chǎn)資源和生活資源。牦牛生長調(diào)控相關(guān)基因功能的研究將有助于逐步闡明其作用機理。為了深入探討牦牛Fas基因的功能，本試驗以天祝牦牛卵巢顆粒細胞為材料，對該基因進行了分子克隆和生物信息學分析，以期為進一步在蛋白水平上研究此基因進化機制、表達特性、編碼蛋白結(jié)構(gòu)及其生理功能等提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

在甘肅省天?？h屠宰場采集5對牦牛卵巢，放于37℃生理鹽水中6 h內(nèi)運回實驗室，并接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 d，待牦牛卵泡顆粒細胞的匯合度達80%～90%時進行RNA提取。

試劑：Ficoll-PaqμeTMPLUS 購自 Amersham Biosciences；Trizol試劑、GoldScript cDNA synthesis kit及 TA Cloning kit購自英駿公司；Ex Taq Mix和TaKaRa LA Taq購自寶生物；Gel Extraction Spin Kit購自GENOMED，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 使用設(shè)計引物1（P1）和引物2（P2）用于天祝牦牛Fas基因克隆。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物1序列F：5-AGTCGGGGCTCACTACTCAC，R：5-TGGAATGGGGTCAACCTGTG；引物 2序列 F：5-TGTTCATCTTCTTGCCTGTT，R：5-TTAGGTAGTTCGGAGCATC。

1.2.2 總RNA的提取 用Trizol法［8］提取天祝牦牛卵泡顆粒細胞總RNA，檢測并調(diào)整濃度后分裝保存于-70℃冰箱中。

1.2.3 RT-PCR分析

1.2.3.1 cDNA的合成 用Invitrogen公司的GoldScript cDNA synthesis kit試劑盒，以oligo dT為引物，按說明進行cDNA第一鏈合成。得到的cDNA用作隨后PCR擴增的模板。

1.2.3.2 PCR擴增 PCR反應(yīng)總體積25μL，各成分用量：10×PCR 緩沖液2μL（Mg2+1.5μmol/L），DNA模板（約 50 ng/μL）0.8 μL，上下游引物（0.25 μmol/L）各 0.6 μL，dNTP（150 μmol/L）0.6 μL，Taq DNA 聚合酶（0.5 U）0.2μL，超純水15.2μL。擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，退火（引物1和引物2退火溫度分別為60℃和 53℃）30 s，72℃延伸 50 s，35 個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3.3 天祝牦牛Fas基因的克隆和測序 按DNA回收試劑盒說明回收特異性條帶，將純化產(chǎn)物與克隆載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，取1.5mL陽性新鮮菌液送北京六合華大基因公司測序。

1.2.4 天祝牦牛Fas基因生物信息學分析 利用Editseq軟件進行序列拼接，用Protean軟件對蛋白結(jié)構(gòu)特征分析，采用MegAlign軟件進行同源性分析，開放閱讀框用NCBI提供的ORF finder程序分析。

基因編碼產(chǎn)物的理化特性采用DNAStar軟件和ProtParam（http://expasy.org/tools/protparam.html）共同分析。蛋白質(zhì)功能采用ProtFun預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）。蛋白信號肽采用SignalP預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域用Interpro預(yù)測（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）。功能位點用PREDICT PROTEIN預(yù)測（http://www.predictprotein.org/）。二級結(jié)構(gòu)用SOPMA預(yù)測（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）。用于同源性分析的其他物種的Fas基因序列從GenBank上下載。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴增

擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖1可見，PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳條帶清晰，特異性良好，片段大小在預(yù)期范圍內(nèi)，與設(shè)計擴增片段相符。

圖1 天祝牦牛Fas基因RT-PCR擴增結(jié)果

2.2 天祝牦牛Fas基因開放閱讀框分析

開放閱讀框是證明一個新的DNA序列為特定蛋白質(zhì)編碼基因的部分或全部的先決條件。本研究采用NCBI的 ORFFinder程序，參照 Kozak 法則［9］，在所獲得的天祝牦牛Fas基因序列中尋找出一條長972 bp的ORF，起始密碼子位于86 bp，終止密碼子位于1 057 bp，推測編碼323個氨基酸殘基。

2.3 天祝牦牛Fas基因編碼蛋白理化特性預(yù)測與分析

運用Expasy服務(wù)器上的ProtParam工具預(yù)測天祝牦牛Fas基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)。Fas基因編碼的323個氨基酸中，Glu所占比例最高，為9%。負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為 44，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為 41。其分子式為C1548H2487N459O497S28，分子質(zhì)量36.37 kDa，理論等電點6.5。Fas基因編碼產(chǎn)物的不穩(wěn)定指數(shù)31.54，根據(jù)Guruprasad原則表明此編碼產(chǎn)物相對穩(wěn)定。

2.4 天祝牦牛Fas基因編碼蛋白親水性/疏水性預(yù)測與分析

疏水性/親水性的分析可為蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及功能分析提供理論參考。運用Expasy服務(wù)器上的Protscale程序，對天祝牦牛Fas蛋白的氨基酸序列進行親水性/疏水性分析，見圖2。多肽鏈的第197位賴氨酸具有最低分值-3.567，親水性最強；第181位的脯氨酸具有最高分值3.556，疏水性最強，整條多肽鏈氨基酸序列表現(xiàn)為親水性。該結(jié)果與DNASTar軟件分析結(jié)果基本一致。

2.5 天祝牦牛Fas基因編碼蛋白信號肽預(yù)測與分析

信號肽位于分泌蛋白的N端，含有信號肽的蛋白質(zhì)一般能夠分泌到細胞外作為重要的細胞因子起作用［10］。運用SignalP 3.0在線軟件對天祝牦牛Fas蛋白進行分析，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（NN）預(yù)測的信號肽結(jié)果如圖3所示，隱馬爾可夫模型（HMM）預(yù)測的信號肽結(jié)果如圖4所示。天祝牦牛Fas蛋白的分值曲線非常典型，C值為0.561，Y值為0.594，S值為0.962，基本可以判定Fas編碼產(chǎn)物存在信號肽。

圖2 天祝牦牛Fas蛋白的疏水性結(jié)果

圖3 NN模型分析天祝牦牛Fas編碼產(chǎn)物信號肽的曲線圖

圖4 HMM模型分析天祝牦牛Fas編碼產(chǎn)物信號肽的曲線圖

2.6 天祝牦牛Fas基因編碼產(chǎn)物功能預(yù)測與分析

運用Protfun分析軟件預(yù)測Fas編碼產(chǎn)物的功能，從表1結(jié)果可知，該蛋白具有受體（Receptor）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控（Transcription regulation）、脅迫應(yīng)答（Stress response）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transducer）和免疫應(yīng)答（Immune response）的可能性分別為 2.772、1.194、1.147、0.920、0.575。表明Fas有可能在受體和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

2.7 天祝牦牛Fas基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)功能位點預(yù)測

用Interpro在線工具預(yù)測了天祝牦牛Fas蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，該序列具有完整的Fas receotpr家族蛋白功能域（圖5）。運用PREDICTPROTEIN在線服務(wù)器對天祝牦牛Fas蛋白分析可知，該蛋白含有3個糖基化位點（分別位于38、115、215位處），2個蛋白激酶C磷酸化位點（分別位于89位和95位處），8個酪蛋白激酶 II磷酸化位點（分別位于 20、44、102、135、144、207、217、227位處），3個肉豆蔻酰化位點（分別位于34、85、245位處），2個酰胺化位點（分別位于62位和277位處），1個TNFR/NGFR家族半胱氨酸富集區(qū)（位于82處）。

表1 天祝牦牛Fas基因編碼產(chǎn)物功能分析結(jié)果

圖5 天祝牦牛Fas基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.8 天祝牦牛Fas蛋白的結(jié)構(gòu)特征分析

用Protean軟件對天祝牦牛Fas蛋白的結(jié)構(gòu)和特性進行了預(yù)測分析，詳見圖6。用Jameson-Wolf方法分析天祝牦牛Fas蛋白潛在的抗原決定簇，結(jié)果表明，該蛋白含有大量抗原指數(shù)較高的區(qū)域。利用Emini方法分析天祝牦牛Fas蛋白的表面可能性區(qū)域主要集中在63～70、85～97、116～125、305～321 和 189～202區(qū)段，其他區(qū)段的可能性較小。

圖6 天祝牦牛Fas蛋白結(jié)構(gòu)和特性

2.9 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA程序?qū)μ熳ｊ笈as氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,結(jié)果表明，天祝牦牛Fas蛋白由35.91%的α-螺旋、7.74%的延伸鏈、52.32%的不規(guī)則卷曲和4.02%的β-轉(zhuǎn)角組成。可推斷無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈是天祝牦牛Fas蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)元件。

2.10 天祝牦牛Fas氨基酸序列同源性分析

應(yīng)用MegAlign軟件對天祝牦牛及普通牛、綿羊、小鼠等10個物種的Fas氨基酸序列進行同源性分析（圖7）。天祝牦牛與普通牛Fas氨基酸序列同源性最高，為98.8%，與綿羊、豬、人的同源性分別為91.3%、67.6%、59.7%，與其他哺乳動物的同源性也都在46.3%以上。蛋白質(zhì)水平之間具有25%的同源性就可提示其功能的相似性［11］。因此，牦牛與其他物種間氨基酸序列間具有較高的保守性。

圖7 10個物種的Fas基因編碼產(chǎn)物序列差別與相似性

3 討論

本實驗克隆了天祝牦牛Fas基因2 605 bp的cDNA序列，包含969 bp的CDS，編碼323個氨基酸，通過蛋白質(zhì)的疏水性、信號肽預(yù)測以及蛋白結(jié)構(gòu)域和蛋白功能位點分析了天祝牦牛Fas基因編碼蛋白功能。并且通過同源性分析發(fā)現(xiàn)，天祝牦牛Fas基因與普通牛的親緣關(guān)系最近，達到了98.8%，其次是綿羊（91.3%）。這種同源性在一定程度上代表著物種親緣關(guān)系的遠近，同時也反映了Fas基因編碼產(chǎn)物在不同物種的結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對生物體功能的重要性［12］。疏水性/親水性分析結(jié)果顯示，天祝牦牛Fas蛋白整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，說明該蛋白質(zhì)的親水性較好，其二級結(jié)構(gòu)很容易接近水分子，為水溶性蛋白。信號肽分析結(jié)果顯示，天祝牦牛Fas抗原同人、小鼠和普通牛的一樣，氨基端含有長22個氨基酸殘基的信號肽。Antonio等［13］發(fā)現(xiàn)，改造了的信號肽可大大提高外源蛋白表達量。提示通過化學修飾可以提高其在機體內(nèi)的表達，從而發(fā)揮更大的生物學功能。編碼蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)果可知，F(xiàn)as蛋白含有死亡結(jié)構(gòu)域（Death）和富半胱氨酸的亞結(jié)構(gòu)域（TNFR/NGFR cysteine），這與Adachi等［12］報道的結(jié)果基本一致。Fas抗原的胞外區(qū)含有3個富含半胱氨酸的重復(fù)區(qū)，為其配體識別位點，破壞該區(qū)域可使其失去與配體結(jié)合及傳遞信號的能力；胞質(zhì)區(qū)域含有一段約80個氨基酸的保守序列，稱為“死亡域”，與TNFα的相應(yīng)片段有很高的同源性，能將胞外的凋亡信號傳到胞內(nèi)［14-15］。蛋白質(zhì)中的功能位點可提供蛋白質(zhì)的功能信息，具有重要的生物學意義。本研究共發(fā)現(xiàn)8個酪蛋白激酶II磷酸化位點。劉善榮等［16］發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)（信號分子）的磷酸化是細胞生長發(fā)育和癌變過程中眾多復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和信號分子參與下最基本的一種反應(yīng)過程。說明該蛋白可能通過啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄并翻譯蛋白質(zhì)，從而在細胞生長和癌變過程中發(fā)揮重要作用。2個蛋白激酶C磷酸化位點和3個肉豆蔻酰化位點的發(fā)現(xiàn)提示，該蛋白與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的磷酸化／去磷酸化有關(guān)。天祝牦牛Fas蛋白的結(jié)構(gòu)特征分析顯示，該區(qū)域抗原指數(shù)較高，呈現(xiàn)在蛋白表面的可能性也較大，推測該區(qū)段的抗原表位應(yīng)該是優(yōu)勢抗原表位所在。同時，功能分析預(yù)測該蛋白具有受體、信號傳導(dǎo)等主要功能，F(xiàn)as是細胞表面重要的死亡受體，其與配體FasL結(jié)合，活化并傳導(dǎo)凋亡信號。這與王強等［17］研究結(jié)果基本一致。說明其在誘導(dǎo)細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

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