劉復(fù)生

（河南省中牟縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，中牟 451450）

片形吸蟲(chóng)屬于片形科、片形屬，該病呈世界性廣泛分布，是一種對(duì)牛羊、駱駝等反芻動(dòng)物和人類危害嚴(yán)重的人畜共患性寄生蟲(chóng)病之一［1］。據(jù)相關(guān)報(bào)道，全球約有7億經(jīng)濟(jì)動(dòng)物感染片形吸蟲(chóng)，給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失；此外，近些年來(lái)關(guān)于人感染片形吸蟲(chóng)病的報(bào)道也較多，在被調(diào)查的60余個(gè)國(guó)家與地區(qū)中，約200萬(wàn)人感染有片形吸蟲(chóng)病，其中我國(guó)云南宜賓縣也有關(guān)于暴發(fā)片形吸蟲(chóng)病感染人類的報(bào)道［2-3］。河南省是我國(guó)奶牛主要養(yǎng)殖地區(qū)，為了促進(jìn)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，本次研究通過(guò)對(duì)中牟縣奶牛進(jìn)行片形吸蟲(chóng)病流行學(xué)調(diào)查，對(duì)片形吸蟲(chóng)線粒體nad1基因進(jìn)行擴(kuò)增與分析，鑒定該地區(qū)片形吸蟲(chóng)的種類，為該病的進(jìn)一步防制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

此次研究所調(diào)查的4個(gè)奶牛場(chǎng)分別來(lái)自河南省中牟縣韓寺鎮(zhèn)、萬(wàn)灘鎮(zhèn)、白沙鎮(zhèn)、大孟鎮(zhèn)，從每個(gè)奶牛場(chǎng)中隨機(jī)抽選60份新鮮糞便樣品，共240份，每份樣品50 g左右，分別標(biāo)記后置于封口袋，待檢。

1.2 蟲(chóng)卵形態(tài)學(xué)鑒定

分別從每個(gè)封口袋中取出糞便40 g左右，利用尼龍袋集卵法收集蟲(chóng)卵，吸取沉渣后在光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定［4］。

1.3 PCR擴(kuò)增

對(duì)獲得的片形吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，用Omega生物技術(shù)公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取絳蚴蟲(chóng)的DNA基因組，以PCR技術(shù)對(duì)蟲(chóng)卵線粒體nad1基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)序列分析對(duì)蟲(chóng)卵進(jìn)行分子學(xué)鑒定。其中引物利用宋慧群等［5］設(shè)計(jì)的引物，上游引物F：5’-AGATTCGTAAGGGGCCTAATA-3’（21 bp），下游引物 R：5’-ACCACTAACTAATTCACT TTC-3’（21 bp），引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。采用25 μL 擴(kuò)增體系：ddH2O 13.75 μL，MgCl24 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0μL，上下游引物（50 pmol/L）各 0.25 μL，DNA聚合酶 0.25μL，模板DNA 2μL，混勻后低速離心，并作空白對(duì)照。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性 30 s，50℃退火 30s，72℃延伸 30 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5 min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%凝膠電泳，將陽(yáng)性樣品回收后送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 nad1基因序列測(cè)定和序列分析

將所獲得的樣品測(cè)序結(jié)果用DNAStar 5.0軟件分析，并從GenBankTM上搜索現(xiàn)有的片形吸蟲(chóng)nad1基因序列，進(jìn)行同源性比較。以豬蛔蟲(chóng)（Ascaris suum）作為外群，利用Clustal X1.8及Mega 4.1程序中的鄰接法（Neighbor-joiningmethod，NJ）繪制種系發(fā)育樹(shù)。鄰接法在軟件默認(rèn)設(shè)置下進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)奶牛片形吸蟲(chóng)流行學(xué)調(diào)查結(jié)果

通過(guò)對(duì)不同地區(qū)共240份奶牛糞便樣品的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共有13份樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率5.41%；韓寺鎮(zhèn)、萬(wàn)灘鎮(zhèn)、白沙鎮(zhèn)、大孟鎮(zhèn)4個(gè)鎮(zhèn)奶牛場(chǎng)奶牛片形吸蟲(chóng)感染率分別為5.0%、3.30%、6.67%和6.67%。詳見(jiàn)表1。

表1 不同地區(qū)奶牛片形吸蟲(chóng)流行學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.2 不同發(fā)育階段奶牛片形吸蟲(chóng)流行學(xué)調(diào)查結(jié)果

通過(guò)分析不同生長(zhǎng)階段奶牛群感染片形吸蟲(chóng)病的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)各生長(zhǎng)階段奶牛群都可以感染片形吸蟲(chóng)，其中以1歲以下的犢牛感染率最低，為3.12%；2歲以上的成年牛的感染率最高，為6.50%；1～2歲的奶牛感染率居中，為4.71%。詳見(jiàn)表2。

表2 不同年齡奶牛片形吸蟲(chóng)流行學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

13個(gè)片形吸蟲(chóng)樣品成功擴(kuò)增出約440 bp的片段，與預(yù)期片形吸蟲(chóng)nad1目的片段大小相符，未出現(xiàn)非特異性條帶，且空白對(duì)照為陰性，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 片形吸蟲(chóng)線粒體線粒體nad1基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

2.4 測(cè)序與序列分析結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，13個(gè)片形吸蟲(chóng)樣品均成功擴(kuò)增出nad1基因片段，大小基本一致，為442～446 bp，通過(guò)與GenBank中所收錄的片形吸蟲(chóng)相關(guān)的nad1序列（EF612491.1、EF612492.1、EF612494.1 與 EF612496.1）進(jìn)行同源性對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1個(gè)片形吸蟲(chóng)樣品檢測(cè)為肝片吸蟲(chóng)，12個(gè)樣品檢測(cè)為大片吸蟲(chóng)，其中肝片吸蟲(chóng)分離株nad1序列與GenBank中收錄的肝片吸蟲(chóng)（EF612494.1和EF612496.1）同源性分別為98.7%和99.3%，12個(gè)大片吸蟲(chóng)分離株nad1與GenBank中收錄的大片吸蟲(chóng)（EF612491.1和EF612492.1）同源性分別為98.6%～99.3%和99.2%～99.8%。使用Mega 4.1軟件的鄰位相連法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建序列的種系發(fā)育樹(shù)（圖2），通過(guò)種系發(fā)育分析，結(jié)果顯示，12個(gè)片形吸蟲(chóng)分離株與GenBank中收錄的大片吸蟲(chóng)（EF612491.1和EF612492.1）位于同一大分支，1個(gè)片形吸蟲(chóng)分離株與GenBank中收錄的肝片吸蟲(chóng)（EF612494.1和EF612496.1）位于同一大分支，得到了很好的鑒別。詳見(jiàn)圖2。

圖2 基于nad1基因序列所構(gòu)建的自展一致樹(shù)

3 討論

本次調(diào)查結(jié)果顯示，中牟縣奶牛片形吸蟲(chóng)病感染率5.41%，調(diào)查結(jié)果明顯低于湘東地區(qū)奶牛片形吸蟲(chóng)病感染率（21.43%）［5］，但高于廣西地區(qū)奶牛片形吸蟲(chóng)病感染率（0）［6］，這說(shuō)明不同地區(qū)奶牛片形吸蟲(chóng)流行情況差異較大。通過(guò)分析不同生長(zhǎng)發(fā)育階段奶牛群片形吸蟲(chóng)病感染情況，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1歲以下?tīng)倥５母腥韭首畹?，?.12%，而1～2歲和2歲以上奶牛群感染率偏高，分別為4.71%和6.50%。

為了明確中牟縣奶牛片形吸蟲(chóng)的種類，本次研究在對(duì)研究所獲得的13個(gè)片形吸蟲(chóng)樣品分離株進(jìn)行了nad1基因序列擴(kuò)增與分析，進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增所得到的13個(gè)片形吸蟲(chóng)樣品分離株線粒體nad1基因序列長(zhǎng)度基本一致，為442～446 bp，其中肝片吸蟲(chóng)分離株nad1序列與GenBank中收錄的肝片吸蟲(chóng)（EF612494.1和EF612496.1）同源性分別為98.7%和99.3%，12個(gè)大片吸蟲(chóng)分離株nad1與GenBank中收錄的大片吸蟲(chóng)（EF612491.1和EF612492.1）同源性分別為98.6%～99.3%和99.2%～99.8%，可以初步確定中牟縣奶牛片形吸蟲(chóng)種類主要為肝片吸蟲(chóng)和大片吸蟲(chóng)，其中大片吸蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)種系發(fā)育樹(shù)也確定了這一結(jié)果。本次研究對(duì)中牟縣乃至河南省奶牛片形吸蟲(chóng)病的診斷和防制及進(jìn)一步分子學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］ 陳芳玲，任佳麗，盧秀紅，等.間接ELISA檢測(cè)百色地區(qū)牛片形吸蟲(chóng)感染情況［J］.廣西畜牧獸醫(yī)，2015，31（2）：84-86.

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［4］ 汪明.獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：226-234.

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