劉書(shū)中，錢(qián) 列，馮 帆，劉祖德，沈洪興，楊絮飛，王以朋，勞立峰*

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 骨科,上海200127；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 骨科,北京100730;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 心內(nèi)科，北京100730)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中的成員，由Urist等于1965年首次報(bào)道，迄今發(fā)現(xiàn)的BMPs已超過(guò)30種，其中BMP-2臨床應(yīng)用最為廣泛[1,2]。近年來(lái)，BMP-2在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等領(lǐng)域的生物學(xué)功能得到進(jìn)一步證實(shí)，但多項(xiàng)研究顯示BMP-2信號(hào)通路尚可參與多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[3-5]。

美國(guó)食品及藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)已批準(zhǔn)將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)應(yīng)用于臨床，目前rhBMP-2多用于脊柱融合手術(shù)及骨不連等骨科疾患的治療中，但近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明rhBMP-2的臨床應(yīng)用可增加多種惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)[4-8]。本研究選用肝癌SK-Hep-1 細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討在體內(nèi)條件下rhBMP-2對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及其可能機(jī)制，為rhBMP-2應(yīng)用于骨科疾病臨床治療并預(yù)防腫瘤發(fā)生發(fā)展提供一定的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

RhBMP-2，來(lái)自UCLA骨科實(shí)驗(yàn)室(加州，美國(guó))；人肝癌細(xì)胞系SK-Hep-1，來(lái)自上海市腫瘤研究所(上海，中國(guó))；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司，其他細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑均為Gibco公司產(chǎn)品；Matrigel購(gòu)自BD Biosciences公司；裸鼠(BALB/c nu/nu)購(gòu)自上海第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(上海，中國(guó))。本研究經(jīng)仁濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則施行。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人類(lèi)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-Hep-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml(純度≥99%)青霉素、100 μg/ mL(純度≥98%)鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，所有細(xì)胞置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2-3天更換一次。

1.2.2設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 本研究中共飼養(yǎng)16只6周齡裸鼠，并將其飼養(yǎng)在SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)條件下(21±1℃、12h日夜交替)。所有裸鼠適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境一周后，隨機(jī)平均分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，接受皮下注射SK-Hep-1細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠背部皮下成瘤模型。

1.2.3裸鼠皮下腫瘤模型的建立 實(shí)驗(yàn)中將16只裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(8只)與對(duì)照組(8只)。本研究中采用裸鼠背部皮下腫瘤異種移植模型，離心后將SK-Hep-1細(xì)胞(1×106)懸浮于30 μl PBS液中，各保存于凍存管中。隨后用70%乙醇和碘伏消毒裸鼠背部皮膚，氯胺酮(4.0 mg/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉成功后施行皮下注射，建立裸鼠背部皮下腫瘤模型。實(shí)驗(yàn)組成瘤方案為200 μl SK-Hep-1細(xì)胞+rhBMP-2+Matrigel+PBS，對(duì)照組成瘤方案為等量的200 μl SK-Hep-1細(xì)胞+Matrigel+PBS。建模成功并做好標(biāo)記后，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組裸鼠分別培養(yǎng)于4只培養(yǎng)籠內(nèi)，4只/籠。

1.2.4數(shù)據(jù)及標(biāo)本采集 裸鼠皮下腫瘤模型建立后，每周測(cè)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組裸鼠成瘤大小并測(cè)算瘤體體積，計(jì)算公式為：體積(mm3) = (瘤體長(zhǎng)徑×瘤體短徑2)×0.5。實(shí)驗(yàn)中的所有裸鼠在第9周處死，于裸鼠背部完整切取成瘤瘤體組織。腫瘤的重量使用精密電子天平儀器測(cè)量。測(cè)量瘤體重量后，將腫瘤標(biāo)本在4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，保存于4℃條件下，通過(guò)一系列濃度遞增的乙醇溶液(40%-100%)進(jìn)行脫水處理，包埋在石蠟中并制備5 μm切片用于免疫組化染色檢測(cè)。

1.2.5免疫組化檢測(cè) 首先將石蠟切片脫蠟并重新水合處理。在室溫下，微波處理置于檸檬酸鈉緩沖液中的切片標(biāo)本。將切片置于H2O2中浸泡30 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，切片在4℃條件下與Ki-67單克隆抗體溫育整夜。在37℃，將切片孵育于HRP標(biāo)記的二抗中2 h。最后，將切片孵育于DAB溶液中30 min。圖像通過(guò)使用Olympus顯微鏡(CX40，Olympus，日本)進(jìn)行盲檢。應(yīng)用圖像分析軟件(Digital Micro System，Jena，Germany)掃描染色區(qū)域來(lái)分析免疫組織化學(xué)光密度(IOD)，對(duì)Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在每張切片中選定四個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)并計(jì)算Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)完成，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的表示方法。Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較裸鼠皮下成瘤體積及瘤體重量，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組裸鼠皮下均建模成功，每周測(cè)量裸鼠皮下成瘤瘤體體積，直至建模9周后處死全部裸鼠。結(jié)果顯示第4周至第9周，實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下瘤體體積均低于對(duì)照組(圖 1)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處死全部裸鼠后，完整切取裸鼠背部皮下腫瘤，測(cè)量實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組裸鼠皮下瘤體重量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下瘤體重量明顯低于對(duì)照組(圖2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)經(jīng)rhBMP-2處理與否小鼠荷瘤組織中ki-67的表達(dá)差異，研究發(fā)現(xiàn)rhBMP-2處理后可顯著降低裸鼠荷瘤組織中ki-67的表達(dá)水平(圖3)，結(jié)果表明體內(nèi)條件下rhBMP-2對(duì)肝細(xì)胞癌SK-Hep-1細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用。

圖1 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下瘤體體積比較

圖2 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下瘤體重量比較

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)裸鼠荷瘤組織中ki-67的表達(dá)情況

3 討論

自從2002年美國(guó)FDA批準(zhǔn)rhBMP-2的臨床使用，其較強(qiáng)的成骨潛力使其逐步成為自體骨移植或同種異體骨移植的有效替代物。在過(guò)去的十年中，rhBMP-2用于脊柱融合手術(shù)及骨不連愈合的臨床治療后，其顯著促進(jìn)骨質(zhì)形成的作用得到國(guó)際上的廣泛認(rèn)可[9]。然而，在脊柱手術(shù)中廣泛使用rhBMP-2也同時(shí)帶來(lái)了一系列的副作用，如增加某些惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)、誘發(fā)神經(jīng)炎癥、逆行射精、異位骨化、局部組織腫脹等嚴(yán)重不良反應(yīng)[10-13]。

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在世界范圍內(nèi)所有癌癥種類(lèi)中患病率位列第五位，約占所有癌癥的7.9%[14]。多種治療策略如手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療，已被廣泛應(yīng)用于肝癌患者的臨床治療中。但是，目前肝癌的臨床治療效果仍有待進(jìn)一步提高，骨轉(zhuǎn)移癌是肝癌的常見(jiàn)并發(fā)癥，缺乏有效的治療手段，臨床預(yù)后較差。研究證實(shí)rhBMP-2對(duì)不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞可發(fā)揮刺激性或抑制性的作用，并在一定程度上依賴其劑量的增長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞類(lèi)型和腫瘤局部微環(huán)境，目前尚缺乏rhBMP-2在HCC細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲及凋亡等多種生物學(xué)行為中的作用及其機(jī)制的研究報(bào)道[4,5,7,8]。Zheng等[15]研究證實(shí)在體外條件下外源性的rhBMP-2可抑制肝細(xì)胞癌Hep G2、Hep 3B細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，其作用可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)和上調(diào)caspase信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。Lao等[4]以肝細(xì)胞癌Hep G2細(xì)胞系為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)rhBMP-2可以在體內(nèi)條件下促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)及骨轉(zhuǎn)移過(guò)程，進(jìn)一步證明分泌性磷蛋白24 kD(spp24)可以阻斷rhBMP-2對(duì)Hep G2細(xì)胞生長(zhǎng)及骨轉(zhuǎn)移的作用，研究證明spp24有望成為肝細(xì)胞癌及肝細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移癌的有效治療劑。而本研究中，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下瘤體體積、重量均較對(duì)照組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，免疫組化檢測(cè)顯示rhBMP-2處理可顯著降低瘤體組織中ki-67的表達(dá)水平。研究表明在體內(nèi)條件下rhBMP-2對(duì)肝癌SK-Hep-1細(xì)胞生長(zhǎng)能力發(fā)揮顯著抑制作用，可能由rhBMP-2抑制肝細(xì)胞癌SK-Hep-1細(xì)胞增殖過(guò)程而導(dǎo)致。綜上所述，我們可以為rhBMP-2應(yīng)用于肝細(xì)胞癌及肝癌脊柱轉(zhuǎn)移癌患者的治療提供一定的基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

本項(xiàng)研究尚存在諸多不足：(1)研究中沒(méi)有設(shè)置spp24對(duì)rhBMP-2及肝細(xì)胞癌SK-Hep-1細(xì)胞系的影響，其相關(guān)性及機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。(2)我們?cè)隗w內(nèi)試驗(yàn)中建立的是裸鼠皮下腫瘤模型，皮下成瘤模型的病理生理?xiàng)l件與原位模型可能不完全相同，肝臟及骨骼原位腫瘤模型可能對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的闡明具有更大的優(yōu)勢(shì)。(3)本研究只是針對(duì)體外條件下rhBMP-2對(duì)肝細(xì)胞癌SK-Hep-1生長(zhǎng)能力的影響，而對(duì)細(xì)胞不同生物學(xué)行為的作用需進(jìn)一步深入探討。

本研究通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體內(nèi)條件下rhBMP-2對(duì)肝細(xì)胞癌SK-Hep-1細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，并可能由rhBMP-2抑制肝細(xì)胞癌SK-Hep-1細(xì)胞增殖過(guò)程而導(dǎo)致。從基礎(chǔ)水平進(jìn)一步論證了rhBMP-2的臨床應(yīng)用不能顯著增加肝細(xì)胞癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，為在脊柱融合手術(shù)及骨不連等骨科疾病的治療中應(yīng)用rhBMP-2提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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